circRNA的ceRNA機制研究文獻解讀

日期：2020-03-05 標簽：ceRNA

結(jié)果表明GC患者miR-424表達增加或LATS1表達降低與病理分期和預(yù)后不良有關(guān)。miR-424的異位表達通過靶向LATS1基因促進GC細胞的增殖和侵襲。此外，circLARP4主要定位于細胞質(zhì)中，通過作為miR-424的海綿吸附體抑制GC細胞的生物學(xué)功能。circLARP4可能是GC中一種新的腫瘤抑制因子和潛在的生物標志物。

為了說明circLARP4通過作為miR-424的海綿吸附體影響其對下游靶標基因LATS1 Mrna的翻譯，作者分為兩個方面進行說明：

（1）GC細胞中miR-424與LATS1 Mrna互作抑制LATS1的表達從而促進細胞的生長；（2）circLARP4對miR-424的吸附抑制細胞生長。下面我們就來看作者是如何來對主題進行說明的。

1、GC細胞的miR-424高表達并以LATS1 mRNA為靶標促進細胞生長和侵襲

（1）MiR-424-5p與GC中的LATS1表達呈負相關(guān)

作者在之前的研究中表明LATS1在GC的表達比對應(yīng)的正常細胞中的含量很低，作者進一步通過使用癌癥基因組圖譜（TCGA）在人胃腺癌（GAC）組織（n = 387）和鄰近的正常組織（n = 41）以及配對的GAC組織（n= 41）中驗證了LATS1的低表達（下圖a）。許多研究表明，miRNA通過抑制其靶基因的表達而在GC發(fā)育中起關(guān)鍵作用，作者推測LATS1可能受GC中的miRNA調(diào)控，于是利用StarBase v2.0，Pictar和miRanda軟件預(yù)測了靶向LATS1基因3'-UTR的潛在miRNA，并鑒定了5個可以與非常高嚴緊度的LATS1基因3'UTR結(jié)合的miRNA，此外，作者研究了GAC中這些miRNA的表達水平，相關(guān)性分析顯示，除has-miR-15b-5p之外，其他miRNA與LATS1表達呈負相關(guān)，其中miR-424-5p（miR-424） 與LATS1表達相關(guān)性最強（下圖b1-b5）。

（2）miR-424以LATS1 mRNA為靶標促進GC細胞的生長和侵襲

證實了miR-424與LATS1在GC組織中的表達呈負相關(guān)，那么LATS1是否是GC細胞中miR-424的靶基因呢？于是作者進行了下面的研究：首先利用mirPath v.3軟件來驗證miR-424是否與LATS1信號通路相關(guān)，結(jié)果是KEGG富集分析表明miR-424主要通過其中LATS1是核成員的Hippo信號傳導(dǎo)途徑富集；然后通過qRTPCR檢測GC細胞系中miR-424和LATS1的表達水平，發(fā)現(xiàn)LATS1表達水平較低，而miR-424表達水平較高，與LESS1表達水平呈負相關(guān)（下圖A）。miR-424 mimics（60μM）和miR-424 inhibit（80μM）分別轉(zhuǎn)染miR-424低表達的HGC-27細胞和miR-424高表達的MKN-28細胞48小時后，qRT-PCR和Western印跡分析顯示HGC-27細胞中miR-424的表達顯著增加并且miR-424模擬物組中LATS1的表達降低（下圖B和C）。熒光素酶實驗表明HGC-27細胞中miR-424 mimics野生型LATS13'UTR的熒光素酶活性明顯降低，而MKN-28細胞中miR-424 inhibit與NC組相比顯著升高，突變型LATS1 3'UTR的熒光素酶活性在miR-424 mimics或inhibit與NC組之間沒有差異（下圖D）。說明miR-424以LATS1 3'UTR為靶標抑制蛋白的表達。

2、circLARP4作為miR-424的海綿吸附體抑制腫瘤細胞生長

（1）circLARP4主要分布于腫瘤細胞質(zhì)中影響細胞的生長和侵襲

越來越多的證據(jù)表明，circRNAs作為miRNAs的海綿吸附體的一種新型的ncRNAs，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并與參與腫瘤發(fā)生的RBPs相互作用。為了鑒定在GC中作為miR-424海綿吸附體的的circRNA，作者應(yīng)用circRNA表達譜和circBase和microRNA.org軟件篩選出30個可以吸附并結(jié)合到miR-424的circRNA（下圖a），通過限定條件這15個circRNA中只有circ_101057符合條件，作者將circ_101057命名為circLARP4。根據(jù)qRT-PCR分析，與線性LARP4相比，circLARP4對RNaseR核酸外切酶誘導(dǎo)的消化產(chǎn)生抗性，證明細胞中circLARP4環(huán)狀結(jié)構(gòu)的存在（下圖c）。通過qRT-PCR分別檢測細胞質(zhì)和細胞核RNA分析顯示，circLARP4大多數(shù)位于細胞質(zhì)中（下圖d）。 此外，作者利用FISH來檢測circLARP4在GC組織細胞中的表達水平和定位，發(fā)現(xiàn)circLARP4在GC組織中的表達低于鄰近正常組織（下圖e）。

（2）circLARP4作為miRNA的海綿吸附體抑制腫瘤細胞生長

由于circRNA可以作為miRNAs海綿，而circLARP4在細胞質(zhì)中穩(wěn)定分布，于是作者首先應(yīng)用ComiR預(yù)測工具以及circLARP4基因組序列來預(yù)測得到可能與circLARP4結(jié)合的5種miRNA，然后用這5種miRNA進行熒光素酶檢測，將pMIR-Luc-circLARP4的螢光素酶報道質(zhì)粒與每種miRNA mimics共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中，與陰性對照（NC）相比，miR-424將熒光素酶報道基因活性降低約75％（下圖A），表明與其他4種miRNA相比，miR-424與circLARP4結(jié)合的可能性更大。miR-424inhibit增加野生型LATS13'UTR的熒光素酶活性，而對突變型LATS1 3'UTR的熒光素酶活性無影響（下圖B）。此外，作者對細胞中的AGO2進行了RNA免疫沉淀（RIP），并通過qRT-PCR分析AGO2拉下來的內(nèi)源性circLARP4和miR-424的表達水平，結(jié)果表明，Ago2抗體從細胞裂解物中沉淀出AGO2蛋白和大量的circLARP4和miR-424（下圖C）。MTT實驗分析circLARP4的表達減弱了HGC-27細胞中由miR-424引起的增殖作用，敲低circLARP4減弱了miR-424inhibit對MKN-28細胞的抗增殖作用（下圖D）。這些結(jié)果說明了circLARP4能夠作為miR-424的海綿吸附體，抑制其在GC細胞中對細胞增殖的促進作用。

文獻原文：Jing Zhang,Hui Liu,Lidan Hou,et al. Circular RNA_LARP4 inhibits cellproliferation and invasion of gastric cancer by sponging miR-424-5p and regulatingLATS1 expression[J].Molecular Cancer,2017, 16:151