A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis

日期：2017-07-28 標(biāo)簽：ceRNA機(jī)制

ceRNA機(jī)制研究案例（四）

一、調(diào)控通路：

LncRNA MD1上有一段miR-133的前體序列。在細(xì)胞分化前，HuR蛋白結(jié)合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切斷裂，Lnc-MD1作為miR-133的海綿吸附體使miR-133前體序列結(jié)合miR-133，解除miR-133對(duì)HuR Mrna翻譯的抑制促進(jìn)HuR的表達(dá)。在細(xì)胞分化時(shí)，Lnc-MD1斷裂釋放miR-133前體使miR-133表達(dá)升高，miR-133結(jié)合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表達(dá)從而使得Lnc-MD1又可作為miR-133的前體。

二、 實(shí)驗(yàn)流程：

作者首先進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HuR與Lnc-MD1的關(guān)系以及對(duì)Lnc-MD1過表達(dá)和敲低后檢測(cè)HuR的表達(dá)，表明LncMD1對(duì)HuR的促進(jìn)作用。隨后分別用RIP和RNA pull-down來驗(yàn)證Lnc-MD1與HuR、Ago2的結(jié)合，用RNA-RNA pull-down驗(yàn)證Lnc-MD1與miR-133結(jié)合。然后通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HuR與Lnc-MD1并驗(yàn)證了與Lnc-MD1的結(jié)合位點(diǎn)說HuR結(jié)合到Lnc-MD1上的miR-133前體序列上。最后作者通過檢測(cè)細(xì)胞分化過程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表達(dá)，以及檢測(cè)HuR敲低后的Lnc-MD1的表達(dá)，表明HuR抑制Lnc-MD1轉(zhuǎn)變?yōu)閙iR-133。

三、核心FIGURE：

Figure1說明的是Lnc-MD1對(duì)HuR蛋白表達(dá)的影響。

A-C、熒光素酶實(shí)驗(yàn)，將HuR mRNA3’-UTR連接到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒上與Lnc-MD1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

E、 Q-PCR檢測(cè)Lnc-MD1過表達(dá)/敲低，WB檢測(cè)Lnc-MD1過表達(dá)/敲低后HuR蛋白的表達(dá)。表明Lnc-MD1促進(jìn)HuR的表達(dá)。

Figure2說明的是HuR與Lnc-MD1結(jié)合后，Lnc-MD1作為miR-133的吸附體結(jié)合miR-133。

A、 RIP實(shí)驗(yàn)，用HuR蛋白抗體從小鼠和人的細(xì)胞中釣取與HuR結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，表明HuR與Lnc-MD1結(jié)合。

B、 Ago2-RIP，用Ago2抗體釣取與Ago2蛋白結(jié)合的RNA，然后然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，表明Ago2與Lnc-MD1結(jié)合。

C、 RNA pull-down/RNA-RNA pull-down，用Lnc-MD1探針釣取與之結(jié)合蛋白和RNA，產(chǎn)物進(jìn)行WB和Q-PCR檢測(cè)，表明Lnc-MD1能與HuR、Ago2蛋白結(jié)合，也與miR-133高度結(jié)合。

D、 EMSA實(shí)驗(yàn)，用Lnc-MD1探針與HuR進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，表明lnc-MD1包含miR-133序列區(qū)段與HuR結(jié)合。

E、 EMSA實(shí)驗(yàn)，用MD1-133b探針與冷探針進(jìn)行體外結(jié)合HuR實(shí)驗(yàn)，表明兩者具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

F、 EMSA實(shí)驗(yàn)，用MD1-133b探針、突變探針和HuR進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，突變后的MD1-133不與HuR結(jié)合。

Figure3說明的是HuR對(duì)Lnc-MD1和miR-133的影響。

A、 細(xì)胞分化過程中WB檢測(cè)HuR，RT-PCR檢測(cè)Lnc-MD1，NB檢測(cè)miR-133的表達(dá)。表明在細(xì)胞分化中期（48-72h）HuR和Lnc-MD1表達(dá)升高，在分化后期HuR和Lnc-MD1表達(dá)下降，而pre-miR-133b和miR-133b的表達(dá)升高。

B、 Lnc-MD1作為miR-133前體的示意圖。

C、 Q-pcr檢測(cè)HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表達(dá)，表明HuR敲低后，Lnc-MD1下降，pre-miR-133b和miR-133b升高。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA、Nortern blot，其中l(wèi)uciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、   luciferase Assay：檢測(cè)microRNA與靶標(biāo)基因3’-UTR的關(guān)系。

將HuR mRNA上包含miR-133結(jié)合位點(diǎn)或miR-133結(jié)合位點(diǎn)缺失的3’-UTR連接到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒上，然后與Lnc-MD1或Lnc-MD1上133結(jié)合位點(diǎn)缺失的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

二、RIP/ago2-RIP實(shí)驗(yàn)：RIP(RNA 免疫共沉淀)技術(shù)主要研究蛋白與RNA的相互作用。

利用HuR抗體從小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞裂解液中釣取與HuR蛋白結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行qrt-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明Lnc-MD1與HuR蛋白結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

Ago2-RIP，Ago2是一種與microRNA結(jié)合后調(diào)控Mrna翻譯的蛋白，本實(shí)驗(yàn)利用Ago2-抗體釣取與ago2蛋白結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，表明Lnc-MD1與Ago2結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

三、RNA pull-down：檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。

用Lnc-MD1探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明Lnc-MD1結(jié)合Ago2和HuR。

四、 RNA-RNA pull-down：檢測(cè)RNA與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段。

用Lnc-MD1探針釣取與之結(jié)合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明miR-133與Lnc-MD1高度結(jié)合。

參考文獻(xiàn)：Ivano Legnini, Mariangela Morlando, Arianna Mangiavacchi，et al. A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis. Molecular Cell,2013, 53, 506–514