The Imprinted H19 LncRNA Antagonizes Let-7 MicroRNAs

日期：2017-07-26 標(biāo)簽：LncRNA,ceRNA,microRNA,Let-7

LncRNA 的CeRNA機(jī)制研究案例（三）

（一）調(diào)控通路：

當(dāng)LncRNA H19低表達(dá)時microRNA Let-7結(jié)合ago2到mRNA的3’-UTR抑制蛋白表達(dá)，當(dāng)LncRNA H19高表達(dá)時LncRNA H19與microRNA Let-7，促進(jìn)mRNA翻譯表達(dá)蛋白。

（二）實驗流程：

作者首先用生物信息學(xué)分析預(yù)測了LncRNA H19與Let-7的結(jié)合位點，然后進(jìn)行熒光素酶實驗驗證H19與Let-7的結(jié)合。Ago2-RIP實驗獲得與ago2蛋白結(jié)合的RNA后進(jìn)行Q-PCR檢測驗證了H19和Let-7都與ago2結(jié)合。隨后，通過H19過表達(dá)/敲低，Let-7敲低檢測下游靶標(biāo)的表達(dá)，然后再一次進(jìn)行熒光素酶實驗驗證H19與Let-7結(jié)合。最后檢測H19和Let-7對細(xì)胞分化的影響。

（三）核心FIGURE：

Figure1 說明的是H19與Let-7相互結(jié)合。

A、Let-7受體的熒光素酶報告質(zhì)粒構(gòu)建策略。

B、熒光素酶活性檢測，分別將Let-7受體和H19熒光素酶報告質(zhì)粒與let-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，結(jié)果表明H19與Let-7結(jié)合。

C、熒光素酶活性檢測，將Let-7受體熒光素酶報告質(zhì)粒和H19表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，結(jié)果表明H19與Let-7受體競爭結(jié)合Let-7。

D、 Ago2-RIP，用ago2抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測，結(jié)果表明H19能與ago2結(jié)合。

E、Ago2-RIP，用ago2抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測，結(jié)果表明H19、Let-7與ago2結(jié)合。

Figure2說明的是H19作為Let-7的海綿吸附體促進(jìn)下游靶標(biāo)基因的表達(dá)。

A、 H19過表達(dá)之后，分別用q-pcr和WB檢測下游靶標(biāo)的Mrna和蛋白的表達(dá)以及Let-7的表達(dá)，結(jié)果表明H19過表達(dá)不影響mRNA和Let-7的表達(dá)，而蛋白的表達(dá)量升高。

B、 Let-7敲低后分別用q-pcr和WB檢測下游靶標(biāo)的mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明Let-7敲低不影響mRNA的表達(dá)，而蛋白的表達(dá)量升高。

C、 H19敲低后分別用q-pcr和WB檢測下游靶標(biāo)的mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明Let-7敲低不影響mRNA的表達(dá)，而蛋白的表達(dá)量升高。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase檢測、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、ago2-RIP，其中的Luciferase檢測、RIP、ago2-RIP為本公司主營項目。

  一、  Luciferase檢測：檢測mRNA的3’-UTR或LncRNA與microRNA的關(guān)系。

本實驗檢測的是LncRNA與microRNA的關(guān)系，分別將Let-7受體和H19熒光素酶報告質(zhì)粒與let-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，結(jié)果表明H19與Let-7結(jié)合。Let-7受體作為對照。

二、Ago2-RIP：主要研究ago2蛋白與RNA的相互作用

本實驗是用ago2蛋白抗體釣取與ago2結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測表明ago2與H19結(jié)合。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

參考文獻(xiàn)：Amanda N. Kallen, Xiao-Bo Zhou, Jie Xu,et al. The Imprinted H19 LncRNA Antagonizes Let-7 MicroRNAs［J］. Molecular Cell,2013, 52, 101–112