Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenous RNA, upregulates hTERT expression by sponging mi R-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer

日期：2017-08-08 標(biāo)簽：Long,noncoding,RNA

一種新的內(nèi)源性RNA  lncRNA BC032469通過作為miR-1207-5p

的海綿吸附體促進(jìn)hTERT的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖

一、 調(diào)控通路

當(dāng)LncRNA BC032469低表達(dá)時，miR-1207結(jié)合到hTERT mRNA的3’-URT抑制mRNA翻譯表達(dá)蛋白，當(dāng)LncRNA BC032469高表達(dá)時，LncRNA BC032467作為miR-1207的海綿吸附體解除其對hTERT mRNA翻譯的抑制，從而促進(jìn)hTERT蛋白的表達(dá)。

二、 實(shí)驗(yàn)流程

作者首先對臨床樣本的胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組合檢測hTERT的表達(dá)，hTERT在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，然后用LncRNA微陣列分析篩選出差異表達(dá)的lncRNA BC032469，再統(tǒng)計(jì)臨床上胃癌病人的存活率與BC032469表達(dá)的關(guān)系。作者對LncRNA BC032469的研究分為兩方面：功能和機(jī)制的研究。（1）功能實(shí)驗(yàn)：先建立LncRNA敲低穩(wěn)定株，然后通過MTT、克隆形成、流式細(xì)胞儀、小鼠體內(nèi)成瘤成瘤實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA的細(xì)胞增殖的作用，另外作者通過免疫組化檢測hTERT的表達(dá)說明LncRNA對hTERT表達(dá)的影響。（2）機(jī)制實(shí)驗(yàn)：作者先用WB實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA敲低后的hTERT的表達(dá)表明LncRNA對hTERT表達(dá)有影響，然后通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LNcRNA并不影響hTERT啟動的活性，表明LncRNA對HTERT表達(dá)的影響不是在轉(zhuǎn)錄水平上的。隨后作者對LncRNA敲低后的microRNA表達(dá)譜分析篩選出表達(dá)差異的miR-1207，然后通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hTERT 3’-urt與miR-1207和LncRNA的關(guān)系，表明LncRNA通過與miR-1207結(jié)合解除miR-1207對mRNA表達(dá)的抑制。另外，作者用斑點(diǎn)印跡法檢測miR-1207與hTERT 3’-UTR和LncRNA的結(jié)合。作者在最后通過RNA-FISH的方法在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證LncRNA與miR-1207的結(jié)合。

一、核心FIGURE

Figure1說明的是LncRNA敲低后hTERT表達(dá)降低，但不影響啟動子活性，同時miR-1207-5p表達(dá)升高。

A、          WB檢測LncRNA敲低后hTERT蛋白的表達(dá)，表明LncRNA敲低后hTERT表達(dá)降低。

B、           熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA與hTERT基因啟動子活性的影響，表明LncRNA不影響啟動子活性。

C、           LncRNA與microRNA的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。

D、          LNcRNA敲低后檢測microRNA的表達(dá)，篩選出差異表達(dá)miR-1207。

Figure2說明的是LncRNA通過作為miR-1207的海綿吸附體促進(jìn)Htert的表達(dá)。

A、          熒光素酶實(shí)驗(yàn)，通過LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補(bǔ)RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207結(jié)合位點(diǎn)突變檢測熒光素酶活性，表明了LncRNA通過與miR-1207結(jié)合調(diào)控Htert 3’-UTR。后圖是用miR-1266作為對照組。

B、           通過LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補(bǔ)RNA、miR-1266反向互補(bǔ)RNA后檢測Htert的表達(dá)，表明了LncRNA通過與miR-1207結(jié)合促進(jìn)Htert的表達(dá)。

C、           斑點(diǎn)印跡法檢測miR-1207與hTERT 3’-UTR和LncRNA的結(jié)合。

D、          RNA –FISH，用miR-1207-5p和LncRNA探針進(jìn)行免疫熒光原位雜交，對細(xì)胞內(nèi)的miR-1207-5p和LncRNA定位表明兩者出現(xiàn)在細(xì)胞的同一位置。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目

本公司可進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、Q-PCR、熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗(yàn)、RNA-FISH，其中熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗(yàn)、RNA-FISH為本公司主營項(xiàng)目。

一、熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗(yàn)：檢測LncRNA、microRNA與靶標(biāo)基因3’-UTR的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)作者通過LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補(bǔ)RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207結(jié)合位點(diǎn)突變檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明了LncRNA敲低與Htert 3’-UTR組的熒光素酶活性顯著下降，添加miR-1207的反向互補(bǔ)序列去結(jié)合miR-1207后熒光素酶活性顯著增強(qiáng)；Htert 3’-URT的1207結(jié)合位點(diǎn)突變與LncRNA敲低組的熒光素酶活性無明顯變化。表明LncRNA通過與miR-1207競爭性結(jié)合，釋放Htert 3’-UTR，促進(jìn)蛋白表達(dá)。

二、RNA-FISH：熒光原位雜交，細(xì)胞中RNA的RNA表達(dá)的定性、定位或定量分析。

本實(shí)驗(yàn)作者用RNA-FISH對細(xì)胞內(nèi)的miR-1207和LncRNA兩種RNA進(jìn)行共定位，驗(yàn)證了miR-1207和LncRNA。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陰性和陽性對照。

參考文獻(xiàn)：M-H Lü, B Tang,S Zeng,et al. Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenousRNA, upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer［J］. Oncogene,2015, 1 – 11