Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2 expression bysponging mi R-331-3p in gastric cancer

日期：2017-08-08 標(biāo)簽：Lnc,RNA

LncRNA作為miR-331-3p的海綿吸附體調(diào)控HER2的表達(dá)

一、   調(diào)控通路

當(dāng)LncRNA HOTAIR低表達(dá)時，miR-331-3p與ago2結(jié)合到HER2 Mrna的3’-UTR抑制翻譯；當(dāng)LncRNA HOTAIR高表達(dá)時，LncRNA HOTAIR競爭性的結(jié)合miR-3313p-ago2，使HER2 mRNA的翻譯不受抑制，從而促進(jìn)了HER2蛋白的表達(dá)。

二、   實驗流程

本文旨在說明LncRNA HOTAIR結(jié)合miR-331-3p后解除其對HER2 mRNA翻譯的抑制從而促進(jìn)HER2蛋白表達(dá)。作者首先根據(jù)臨床樣本進(jìn)行Q-PCR檢測正常組織細(xì)胞核胃癌細(xì)胞的LncRNA HOTAIR的表達(dá)和存活率與LncRNA HOTAIR表達(dá)量關(guān)系的分析篩選出本文的主體LncRNA HOTAIR。再進(jìn)行功能和作用機制兩方面的研究。（1）功能實驗：通過建立LncRNA HOTAIR過表達(dá)/敲低穩(wěn)定細(xì)胞株，分別進(jìn)行MTT實驗、Hoechst染色、流式細(xì)胞儀、Transwell、動物體內(nèi)成瘤實驗驗證LncRNA HOTAIR對細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡的影響。（2）機制實驗：生物信息學(xué)分析表明LncRNA HOTAIR有與microRNA的結(jié)合位點，作者通過熒光素酶實驗驗證了LncRNA HOTAIR與miR-331-3p的結(jié)合，同樣的用熒光素酶實驗檢測HER2 3’-UTR與miR-331-3P的關(guān)系，然后用Ago2-RIP技術(shù)驗證了LncRNA HOTAIR與miR-331-3p-Ago2結(jié)合。最后通過使用WB檢測LncRNA HOTAIR過表達(dá)/敲低后的HER2蛋白的表達(dá)驗證了LncRNA HOTAIR對HER2的促進(jìn)作用。

三、   核心FIGURE

Figure1說明LncRNA HOTAIR以miR-331-3p為靶標(biāo)來調(diào)控HER2的表達(dá)。

A、          生物信息學(xué)預(yù)測LncRNA HOTAIR與microRNA的結(jié)合位點。

B、           熒光素酶實驗，將連接LncRNA的熒光素酶報告質(zhì)粒與microRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，結(jié)果表明LncRNA HOTAIR與miR-331-3p的熒光素酶活性顯著降低，說明LncRNA HOTAIR與miR-331-3p高度結(jié)合。

C、           熒光素酶實驗，將HER2 3’-utr連到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與LncRNA HOTAIR表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，然后轉(zhuǎn)染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性，HOTAIR促進(jìn)熒光素酶活性。

D、          Ago2-RIP，用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2-結(jié)合的RNA，然后通過q-pcr檢測表明Ago2結(jié)合LncRNA HOTAIR和miR-331-3p。

E、           通過WB檢測miR-331-3p過表、HOTAIR敲低和過表達(dá)細(xì)胞的HER2的表達(dá)，說明miR-331-3p抑制HER2表達(dá)，而HOTAIR促進(jìn)HER2的表達(dá)。

                      本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

    本公司可進(jìn)行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、luciferase Assay、Ago2-RIP，其中Ago2-RIP、luciferase Assay為本公司主營項目。

一、luciferase Assay：檢測microRNA與靶標(biāo)基因3’-UTR的關(guān)系。

將HER2 3’-utr連到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與LncRNA HOTAIR表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，然后轉(zhuǎn)染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性，HOTAIR促進(jìn)熒光素酶活性。也就是說HOTAIR解除了MiR-331-3p對蛋白表達(dá)的抑制。

二、Ago2-RIP：主要研究ago2蛋白與RNA的相互作用

用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2結(jié)合的RNA，然后通過q-pcr檢測，結(jié)果表明Ago2結(jié)合LncRNA HOTAIR和miR-331-3p。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

參考文獻(xiàn)：Xiang-hua Liu, Ming Sun, Feng-qi Nie,et al. Lnc RNA HOTAIR functions as a competingendogenous RNA to regulate HER2 expression bysponging mi R-331-3p in gastric cancer. Molecular Cancer,2014,13:92