H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma

日期：2017-07-14 標(biāo)簽：Lnc,CCAT1,ceRNA,ago2

ceRNA研究案例（二）

（一）調(diào)控通路圖

 在細(xì)胞核內(nèi)，LncCCAT1將PRC2和SUV39H1結(jié)合到SPRY4啟動子上促進(jìn)啟動子組蛋白甲基化，抑制SPRY4的表達(dá)；在細(xì)胞質(zhì)中，LncCCAT1作為miR-7的內(nèi)源性海綿吸附體結(jié)合miR-7使HOXB13 mRNA翻譯不受miR-7-ago2抑制。

（二）實(shí)驗(yàn)流程：

       1、LncRNA CCAT1篩選：作者首先通過食管鱗狀細(xì)胞癌和癌旁組織的LncRNA芯片分析篩選出在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)的LncRNA CCAT1，然后用QRT-PCR驗(yàn)證，并且用生物信息學(xué)分析預(yù)測與LncRNA CCAT1結(jié)合的靶標(biāo)。

        2、LncRNA CCAT1功能實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建慢病毒過表達(dá)和敲低穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)行MTT、Brdu實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA CCAT1對細(xì)胞增殖的影響，另外向小鼠體內(nèi)注射細(xì)胞檢測細(xì)胞瘤形成情況。

        3、機(jī)制實(shí)驗(yàn)：機(jī)制實(shí)驗(yàn)分為兩部分

         一是LncRNA CCAT1將EAH2和SUV39H結(jié)合到SPRY4的啟動子上促進(jìn)啟動子組蛋白甲基化，抑制SPRY4基因的表達(dá)。作者首先進(jìn)行RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LncRNA CCAT1與EZH2和SUV39H結(jié)合，然后進(jìn)行CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了EZH2和SUV39結(jié)合到SPRY4啟動子上并促進(jìn)組蛋白H3K9甲基化。最后通過對LncRNA CCAT1、EZH2、SUV39H的過表達(dá)/敲低后檢測SPRY4的表達(dá)。

         二是LncRNA CCAT1作為miR-7的海綿吸附體結(jié)合miR-7，解除miR-7對HOXB13 mRNA翻譯的抑制。首先通過啟動子熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA CCAT1與HOXB13啟動子的關(guān)系表明LncRNA CCAT1對HOXB13啟動子活性無影響，然后檢測LncRNA CCAT1過表達(dá)/敲低后的miR-7表達(dá)，miR-7 mimics的HOXB13的表達(dá)。之后進(jìn)行HOXB13的3'-UTR熒光素酶檢測表明miR-7對HOXB13的3'-UTR的作用。最后用RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LncCCAT1與miR-7-ago2復(fù)合體結(jié)合。

（三）核心FIGURE：

Figure1說明的是LncRNA CCAT1通過將EZH2和SUV39H1結(jié)合到SPRY4啟動子上抑制SPRY4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

A、RNA pull-down，用LncRNA CCAT1探針釣取與之結(jié)合的蛋白，用EZH2和AUV39H1抗體進(jìn)行WB檢測，結(jié)果表明LncRNA CCAT1與EZH2和AUV39H1蛋白結(jié)合。

B、RIP實(shí)驗(yàn)，分別用蛋白抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA，結(jié)果表明LncRNA CCAT1與蛋白EZH1、AUV39H1結(jié)合。

C、CHIP實(shí)驗(yàn)，分別用SUV39H1和H3K9me3抗體釣取LncRNA CCAT1敲低和過表達(dá)細(xì)胞中的結(jié)合DNA片段，然后用SPRY4啟動子引物進(jìn)行Q-PCR檢測，結(jié)果表明LncRNA CCAT1過表達(dá)細(xì)胞與敲低細(xì)胞相比，過表達(dá)細(xì)胞的SUV39H1結(jié)合到SPRY4啟動子上并且使組蛋白甲基化程度明顯增加。

D、LncRNA CCAT1的過表達(dá)和EZH2、SUV39H1的敲低后，用Q-PCR檢測SPRY4的表達(dá)，結(jié)果表明只有LncRNA CCAT1過表達(dá)時SPRY4低表達(dá)，而同時過表達(dá)LncRNA CCAT1和敲低EZH2或SUV39H1時SPRY4高表達(dá)。

E、細(xì)胞活性檢測，上圖為SPRY4過表達(dá)的WB檢測，下圖為LncRNA CCAT1的過表達(dá)后抑制SPRY4對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

Figure2說明的是LncRNA CCAT1與miR-7結(jié)合下調(diào)miR-7，促進(jìn)HOXB13 mRNA翻譯表達(dá)。

A、 WB實(shí)驗(yàn)，檢測LncRNA CCAT1敲低和過表達(dá)細(xì)胞的HOXB13表達(dá)情況，結(jié)果表明LncRNA CCAT1促進(jìn)HOXB13的表達(dá)。

B、 熒光素酶檢測LncRNA CCAT1與HOXB13啟動子關(guān)系，表明LncRNA CCAT1對HOXB13啟動子的轉(zhuǎn)錄活性無影響。

C、 Q-PCR檢測LncRNA CCAT1敲低和過表達(dá)的miR-7的表達(dá)，結(jié)果表明LncRNA CCAT1敲低時miR-7高表達(dá)，LncRNA CCAT1過表達(dá)時miR-7低表達(dá)。說明LncRNA CCAT1可能是通過調(diào)控miR-7來調(diào)控HOXB13的表達(dá)。

D、 通過增強(qiáng)miRNA功能檢測HOXB13的表達(dá)，結(jié)果說明miR-7抑制HOXB13的表達(dá)。

E、 熒光素酶檢測LncCCAT1、miR-7和HOXB13 3'-UTR的關(guān)系，結(jié)果表明LncRNACCAT1、HOXB13 3'-UTR的熒光樹酶活性均受miR-7下調(diào)。

F、 熒光素酶檢測LncCCAT1和HOXB13 3'-UTR的關(guān)系。

G、 RIP實(shí)驗(yàn)，用ago2抗體釣取與ago2蛋白結(jié)合的RNA，q-pcr檢測產(chǎn)物，表明LncCCAT1能結(jié)合miR-7-ago2復(fù)合體。

H、 檢測LncCCAT1過表達(dá)、miR-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的HOXB13表達(dá)，表明miR-7下調(diào)HOXB13，而LncCCAT1抑制miR-7的下調(diào)作用。

I-J、細(xì)胞活性檢測，表明LncCCAT1通過促進(jìn)HOXB13表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵染。

我們公司可以提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括RIP、CHIP、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、WB、Q-PCR、熒光素酶實(shí)驗(yàn)、miRNA-mimics，其中RNA pull-down、RIP、CHIP、熒光素酶實(shí)驗(yàn)為本公司主營項(xiàng)目。

一、RNA pull-down：檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。

用Lnc CCAT1生物素標(biāo)記探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測，表明了Lnc CCAT1結(jié)合EZH2和SUV39H1，并且EZH2結(jié)合在LncRNA的5’端，SUV39H1結(jié)合在3’端。

二、RIP實(shí)驗(yàn)：RIP(RNA 免疫共沉淀)技術(shù)主要研究蛋白與RNA的相互作用

利用相應(yīng)蛋白抗體，在全蛋白提取液中捕蛋白-RNA復(fù)合體，洗脫RNA，反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測表明了LncCCAT1與SUV39H1、EZH2以及SUZ12高度結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

三、 CHIP實(shí)驗(yàn)：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測。本實(shí)驗(yàn)分別用SUV39H1和H3K9me3抗體釣取DNA片段后用Q-PCR檢測表明SPRY4的啟動子結(jié)合SUV39H1和H3K9me3蛋白。

四、 螢光素酶活性實(shí)驗(yàn)（luciferase Assay）：一類是檢測轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，一類是檢測miRNA與靶基因3’UTR作用關(guān)系，通過不同的熒光素酶載體實(shí)現(xiàn)。

          例一：啟動子熒光素酶實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的是LncCCAT1與HOXB13啟動子之間的關(guān)系，通過構(gòu)建CCAT1的RNA干擾轉(zhuǎn)染細(xì)胞株檢測HOXB3啟動子活性，以CCAT1非干擾為對照，表明了LncCCAT1對HOXB3啟動子活性無影響。

         例二：3'-UTR熒光素酶實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-7對HOXB13 3’-UTR作用調(diào)控基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明miR-7功能增強(qiáng)對靶基因的表達(dá)起下調(diào)作用，而3’-UTR突變后靶基因表達(dá)不受miR-7影響。

參考文獻(xiàn)：Erbao Zhang , Liang Han, Dandan Yin，et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Nucleic Acids Research, 2016, 10.1093