Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal

日期：2017-07-13 標(biāo)簽：LncRNA-ROR,sponge,miR-145

ceRNA研究案例（一）

（一）調(diào)控通路：

在細(xì)胞的自我更新過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子nanog、sox2和oct4促進(jìn)Lnc-ROR的表達(dá)，之后Lnc-ROR作為miR-145的內(nèi)源性海綿吸附體，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子nanog、sox2和oct4的表達(dá)。

（二）實(shí)驗(yàn)流程：

作者首先使用RNA FISH實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)未分化和分化細(xì)胞中的LncROR的表達(dá)和分布說(shuō)明LncROR與細(xì)胞分化有關(guān)，然后研究LncROR的調(diào)控機(jī)制。作者用WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ROR過(guò)表達(dá)/敲低后的OCT4等蛋白的表達(dá)來(lái)說(shuō)明LncROR對(duì)蛋白表達(dá)的影響，然后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-145與OCT4等mRNA的關(guān)系和miR-145與ROR的關(guān)系。Q-pcr檢測(cè)ROR敲低后的miR-145前體和成熟體的表達(dá)說(shuō)明ROR對(duì)miR-145表達(dá)的影響，隨后對(duì)miR-145、LncROR敲低檢測(cè)OCT4等的表達(dá)驗(yàn)證RNA對(duì)靶標(biāo)的影響。此外，作者通過(guò)檢測(cè)OCT4等敲低檢測(cè)LncROR的表達(dá)和CHIP實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明OCT4等蛋白促進(jìn)LncROR表達(dá)。

（三）核心FIGURE：

Figure2說(shuō)明的是LncRNA ROR通過(guò)與miRNA的海綿吸附作用，促進(jìn)OCT4、Nanog、SOX2的表達(dá)。

A、 先用Q-PCR分別檢測(cè)OCT4和Nanog敲低后的LncROR的表達(dá)，然后用CHIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與OCT4、Nanog、SOX2結(jié)合的DNA片段，結(jié)果表明OCT4、Nanog、SOX2結(jié)合到LncROR啟動(dòng)子上促進(jìn)LncROR的表達(dá)。

B、 分別Q-PCR和WB檢測(cè)LncROR過(guò)表達(dá)和敲低后的OCT4、Nanog、SOX2的表達(dá)，結(jié)果表明LncROR與OCT4、Nanog、SOX2的表達(dá)正相關(guān)。

C、 miRNA與OCT4、Nanog、SOX2以及LncROR結(jié)合能力的檢測(cè)，以miR-16-5b為陰性對(duì)照，結(jié)果表明幾種miRNA與OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的結(jié)合能力很高。

D、 熒光素酶活性檢測(cè)miRNA與OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的關(guān)系，結(jié)果表明miRNA抑制OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的表達(dá)活性。

E、 熒光素酶活性檢測(cè)miR-145結(jié)合LncROR結(jié)合的位點(diǎn)。

F、 熒光素酶活性檢測(cè)LncROR誘導(dǎo)的OCT4等基因的3’-UTR與miR-145的關(guān)系，結(jié)果表明miR-145抑制蛋白的表達(dá)，而LncROR會(huì)降低miR-145的抑制作用。

  G-H、Q-pcr檢測(cè)miR-145初始轉(zhuǎn)錄本、miR-145前體和成熟miR-145的表達(dá)水平，結(jié)果表明LncROR影響miR-145的表達(dá)。

  I、通過(guò)miR-145和LncROR的敲低檢測(cè)OCT4、Nanog、SOX2，結(jié)果表明miR-145負(fù)調(diào)控OCT4、Nanog、SOX2，LncROR正調(diào)控OCT4、Nanog、SOX2。

  J、蛋白FISH，在細(xì)胞水平上直觀檢測(cè)LncROR敲低后的下游靶標(biāo)蛋白的表達(dá)。

                  本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過(guò)表達(dá)/敲低）、luciferase Assay、CHIP、，其中CHIP、luciferase Assay為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、CHIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)：CHIP實(shí)驗(yàn)主要研究蛋白與DNA之間的關(guān)系

用目的基因蛋白抗體釣取與之結(jié)合的DNA片段，然后用Lnc-ROR啟動(dòng)子區(qū)引物進(jìn)行q-pcr檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合蛋白。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在細(xì)胞自我更新中OCT4、Nanog、SOX2結(jié)合到Lnc-ROR啟動(dòng)子上。

二、熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)（luciferase Assay）：檢測(cè)microRNA與靶標(biāo)基因3'-UTR的關(guān)系。

通過(guò)構(gòu)建miR-145表達(dá)質(zhì)粒和靶標(biāo)基因3’-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用LncROR誘導(dǎo)檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果明了miR-145抑制蛋白的表達(dá)，而LncROR會(huì)降低miR-145的抑制作用。

三、FISH技術(shù)：免疫熒光原位雜交，對(duì)細(xì)胞中的核酸和蛋白進(jìn)行定性、定位和定量。

分別用幾種蛋白的抗體在細(xì)胞水平上直觀檢測(cè)LncROR敲低后的下游靶標(biāo)蛋白的表達(dá)，從FISH結(jié)果我們可以直觀的看出LncROR敲低后，其下游靶標(biāo)的蛋白表達(dá)量明顯增加。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

參考文獻(xiàn): Yue Wang, Zhenyu Xu, Junfeng Jiang,et al. Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2

in Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal［J］. Developmental Cell，2013， 25, 69–80