參與m6A RNA修飾和功能相關(guān)的蛋白

日期：2020-03-05 標(biāo)簽：m6A

目前的大量研究表明m6A修飾主要發(fā)生在細(xì)胞核中，而其功能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，與這個(gè)概念相一致，m6A“作者”（METTL3，METTL14，WTAP）和“消除者”FTO、ALKBH5主要存在于細(xì)胞核中，對(duì)RNA進(jìn)行甲基化修飾或者去甲基化；而大多數(shù)“閱讀者”YTHDF1、YTHDF2存在于細(xì)胞質(zhì)中，與m6A RNA的翻譯、降解等功能相關(guān)。

1、m6A RNA的“作者”---腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3，METTL14，WTAP

m6A mRNA甲基化是由多組分甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化的，最初被分離為來自HeLa核提取物的約200kDa和約800kDa的亞復(fù)合物，METTL3較早被鑒定為該復(fù)合物的S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）結(jié)合組分，并且可以顯示其自身的催化功能，METTL3在真核生物中高度保守。

目前已有證據(jù)證明METTL3在m6A修飾中具有重要作用：在HeLa細(xì)胞中敲減METTL3導(dǎo)致總m6A水平下降約30％，并且在HepG2細(xì)胞中相同的敲低實(shí)驗(yàn)可能通過激活p53介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；敲低METTL3降低了來自小鼠胚胎干細(xì)胞Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞mRNA中的m6A峰，METTL3 / 2小鼠交配產(chǎn)生的囊胚中METTL3的基因消除導(dǎo)致mRNA上m6A幾乎完全耗盡，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了METTL3在m6A修飾中的關(guān)鍵作用。

METTL14是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一種活性成分，與METTL3形成穩(wěn)定的雜合復(fù)合物，METTL14與METTL3緊密同源，純化的METTL14也能特異性甲基化共有的GAC基序，而METTL14的敲低也可能導(dǎo)致mRNA中m6A含量的降低。

生物化學(xué)表征顯示這兩種蛋白質(zhì)以1：1的化學(xué)計(jì)量比形成穩(wěn)定的復(fù)合物。盡管METTL14的甲基化活性在體外略高于METTL3，但甲基轉(zhuǎn)移酶的組合導(dǎo)致甲基化活性顯著增強(qiáng)。這種異源二聚體還顯示出對(duì)同源m6A共有序列的強(qiáng)烈偏好和對(duì)體外結(jié)構(gòu)較少的RNA的適度偏好。更有研究表明，這兩個(gè)組分在細(xì)胞中形成復(fù)合物的甲基化活性比分開的部分活性更高。

WTAP是體內(nèi)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的第三個(gè)關(guān)鍵組分。WTAP最初被鑒定為與Wilms腫瘤1（WT1）蛋白結(jié)合的剪接因子，對(duì)于細(xì)胞周期和早期哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要。WTAP在m6A甲基化中的重要作用首先在酵母和擬南芥中發(fā)現(xiàn)，分別研究其同源物Mum2和FIP37，發(fā)現(xiàn)它們與METTL3結(jié)合，是mRNA高效甲基化所必需的。

WTAP與METTL3和METTL14相互作用，并與METTL3-METTL14異二聚體在細(xì)胞核內(nèi)共定位以參與m6A RNA甲基化，盡管WTAP單獨(dú)在體外沒有顯示任何甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但敲除WTAP顯著降低了細(xì)胞mRNA中的m6A峰，甚至比敲低METTL3或METTL14更顯著。

圖2  甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的對(duì)m6A RNA的作用

2、m6A RNA的“消除者”---去甲基化酶FTO和ALKBH5

FTO是ALKB家族的成員。FTO是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)RNA去甲基化酶，是m6A生物學(xué)研究的一個(gè)重要突破。Fto基因最初是在缺失導(dǎo)致突變小鼠融合表型的4個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)的。FTO最初顯示在單鏈DNA中N3-甲基胸腺嘧啶核苷和單鏈RNA中的N3-甲基尿苷在體外去甲基化;然而，體內(nèi)FTO的功能仍然是未知的，直到發(fā)現(xiàn)FTO在體外m6A有效去甲基化RNA和DNA。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示HeLa和293FT細(xì)胞中FTO的沉默增加了聚腺苷酸化RNA中的總m6A水平，并且FTO的過表達(dá)降低了RNA上的m6A水平。FTO失調(diào)與肥胖，腦畸形和生長(zhǎng)遲緩的相關(guān)性，m6A可能在這些疾病中具有重要的調(diào)節(jié)功能。FTO作為m6A去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)提示了m6A在人類發(fā)育調(diào)節(jié)中的功能作用，為了達(dá)到揭示潛在機(jī)制的最終目標(biāo)，需要大量的未來工作來鑒定FTO的生理RNA靶標(biāo)并闡明這種去甲基化的功能性后果。

ALKBH5是AlkB家族的另一種蛋白質(zhì)，在mRNA和其他類型的核糖核酸中顯示出對(duì)m6A的高效去甲基活性。與FTO不同的是，ALKBH5催化反應(yīng)直接從m6A-甲基化腺苷上去除甲基，而不是氧化去甲基化。Alkbh5基因敲除的小鼠顯示睪丸中凋亡細(xì)胞顯著增加，表明精子發(fā)生缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，除了mRNA之外，其他類型的核RNA也是ALBKH5的底物。

3、m6A RNA的“閱讀者”---m6A特異結(jié)合蛋白YTHDF1-3、eIF3、HNRNPC和HNRNPA2B1

m6A RNA甲基化和去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)表明m6A修飾是動(dòng)態(tài)和可逆的，這與表觀遺傳DNA和組蛋白修飾相似。對(duì)于m6A組具有生物學(xué)功能，則需要通過特定蛋白質(zhì)的識(shí)別來完成。

可以設(shè)想m6A在RNA上的三種選擇性機(jī)制：首先，識(shí)別蛋白可以選擇性地與含m6A的RNA結(jié)合;其次，特定序列中m6A的存在可能削弱RNA與結(jié)合蛋白相互作用;第三，m6A的存在可能改變RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而改變蛋白質(zhì)-RNA相互作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已經(jīng)鑒定了三種宿主蛋白YTHDF1,2和3（YTHDF1-3）作為選擇性m6A結(jié)合蛋白（“閱讀者”）。 

三種YTHDF蛋白都含有保守的羧基末端YTH結(jié)構(gòu)域 結(jié)合m6A和功能不清的更可變的氨基末端效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。已有證據(jù)證實(shí)哺乳動(dòng)物YTHDF蛋白優(yōu)先結(jié)合于G [G> A] m6ACU共有序列處含有m6A的RNA。

用YTHDF1-3免疫沉淀的RNA中m6A的富集進(jìn)一步支持YTHDF蛋白作為m6A特異性RNA結(jié)合蛋白的作用，RNA免疫沉淀和PAR-CLIP實(shí)驗(yàn)顯示除了一些lncRNA靶標(biāo)之外，大多數(shù)mRNA作為YTHDF2的靶標(biāo)。許多研究表明m6A閱讀器蛋白YTHDF2識(shí)別m6ARNA并介導(dǎo)甲基化RNAs的降解，而YTHDF1和3則與促進(jìn)m6A的mRNA的翻譯。

圖3  YTHDC1介導(dǎo)m6A修飾的mRNA轉(zhuǎn)移

真核起始因子3（eIF3）是43S翻譯起始復(fù)合物的一個(gè)組成部分，最近報(bào)道eIF3與5’ UTR m6A直接結(jié)合。研究顯示，eIF3結(jié)合位點(diǎn)主要定位于mRNA的5’UTRs，這對(duì)于調(diào)節(jié)翻譯起始是重要的。YTHDF1被報(bào)道與eIF3相互作用，研究人員發(fā)現(xiàn)，eIF3與5’UTR m6A的結(jié)合與YTHDF1無關(guān)，從而支持eIF3能夠直接結(jié)合m6A。

HNRNPC是已知參與mRNA前體加工的豐富的核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，進(jìn)一步的研究顯示m6A對(duì)HNRNPC-RNA結(jié)合的調(diào)節(jié)影響靶轉(zhuǎn)錄物的豐度和選擇性剪接。

HNRNPA家族的另一個(gè)成員HNRNPA2B1的結(jié)合位點(diǎn)中RGAC元件的高度富集，表明HNRNPA2B1是m6A閱讀者候選者。進(jìn)一步的研究表明，與背景缺失相比，HNRNPA2B1交聯(lián)誘導(dǎo)的缺失與m6A峰重疊20倍，這支持HNRNPA2B1作為m6A閱讀器直接結(jié)合m6A共有序列的子集。此外，HNRNPA2B1與作為pri-miRNA微處理器復(fù)合物的組分的DGCR8蛋白相互作用，并促進(jìn)pri-miRNA的加工。

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