關(guān)于mRNA上的m6A富集分析文獻解讀

日期：2017-10-13 標簽：m6A

Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and Near Stop Codons

小編今天給大家?guī)硪黄?span style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important;">2012年cell雜志發(fā)表的 關(guān)于m6A在mRNA上富集的綜合分析文獻解讀和文獻中研究方法的介紹。

文獻摘要：m6A在RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾中是普遍存在的，而之前發(fā)現(xiàn)的肥胖疾病相關(guān)的基因FTO基因能編碼一種m6A去甲基酶影響m6A，是生理學(xué)進程中重要的調(diào)控作用。本文介紹的是一種在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)分析m6A分布的方法：MeRIP-Seq。作者用這種方法鑒定出來7,676個哺乳動物的包含m6A的mRNA基因，表明了m6A是mRNA共有的分子堿基修飾作用，同時m6A表現(xiàn)出來很強組織特異性調(diào)節(jié)并且在大腦發(fā)育過程中明顯增加。作者發(fā)現(xiàn)m6A在mRNA的3’-UTR區(qū)和終止密碼子附近含量豐富，并且m6A的富集區(qū)域與3’-UTR的microRNA結(jié)合區(qū)相關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種哺乳動物轉(zhuǎn)錄組表觀調(diào)控的觀點。

1、哺乳動物mRNA的m6A檢測

作者首先通過dot blot的方法驗證m6A抗體是否能與RNA上的m6A產(chǎn)生免疫反應(yīng)，先分別將m6A修飾的寡聚核苷酸和非修飾的寡聚核苷酸點在尼龍膜上，然后用m6A抗體進行免疫反應(yīng)，再將m6A修飾的寡聚核苷酸點在膜上，用于免疫反應(yīng)的m6A抗體分別用不同濃度的修飾RNA和非修飾的RNA競爭結(jié)合后與膜上的m6A修飾的RNA進行免疫反應(yīng)，說明該m6A抗體只和m6A修飾的RNA產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

 圖注：A是不同濃度的M6A修飾和未修飾的RNA與m6A抗體的免疫反應(yīng)，B是用M6A修飾的RNA和未修飾的RNA與膜上的M6A修飾的RNA競爭性結(jié)合m6A抗體，表明m6A抗體與m6A修飾的RNA結(jié)合而與未修飾的RNA不結(jié)合。

隨后作者通過檢測不同組織中m6A說明神經(jīng)組織的RNA甲基化比其他組織高，并且在整個大腦發(fā)育過程中m6A含量豐富。作者用寡聚核苷酸（dT）進行RNApull-down釣取細胞Mrna后用m6A抗體進行免疫檢測說明mRNA的甲基化，然后通過寡聚核苷酸（dT）雜交獲取的mRNA用RNaseH（一種降解polyA尾的RNA水解酶）處理后再進行免疫檢測說明Mrna的m6a修飾不是在poly(A)尾上。

圖注：A是小鼠不同組織RNA的m6A檢測，B是小鼠生長不同階段的大腦組織RNA的m6A檢測，C是用寡聚核苷酸Dt序列釣取細胞的mRNA然后檢測m6A，D是釣取的Mrna用RnaseH去除Mrna的poly(A)尾后檢測m6A。

2、MeRIP-Seq檢測轉(zhuǎn)錄組中含m6A的RNA

為了檢測RNA上的m6A，作者通過MeRIP先將細胞總RNA片段化為大約100bp左右，用m6A抗體釣取細胞含m6A的RNA片段，然后進行高通量測序分析m6A的位置，表明大部分的m6A在mRNA的3’端。隨后作者用其中的Ldlr mRNA的反向互補序列作為探針釣取細胞的Ldlr mRNA進行m6A的免疫反應(yīng)驗證。

圖注：A為MeRIP-Seq的數(shù)據(jù)分析中mRNA甲基化的信息，B為Ldlr mRNA的RNA-RNApull-down后進行m6A免疫檢測驗證Ldlr mRNA甲基化。

MeRIP-Seq數(shù)據(jù)分析表明m6A集中在在motif G[AG]ACU和其變體[AC]GAC[GU],GGAC, [AU][CG]G[AG]AC上，并且在U-rich的motif上幾乎不含m6A。

3、本文所用的主要研究方法

（1）dot blot：斑點雜交印跡法。

先將m6A修飾的RNA固定在尼龍膜上，然后用m6A抗體進行免疫反應(yīng)，分別用m6A修飾的RNA和未修飾的RNA作為m6A抗體的競爭結(jié)合探針，在加入m6A修飾的RNA時，隨著加入的RNA量增加，抗體與膜上的RNA反應(yīng)降低；而加入非修飾的RNA時，抗體與膜上的RNA反應(yīng)不受影響

（2）MeRIP-Seq：m6A特異性的甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)

MeRIP-Seq實驗方法：先將提取的細胞總RNA進行片段化處理，然后與m6A抗體一起孵育，再用磁珠吸附m6A抗體與m6A-RNA的復(fù)合體，洗脫的RNA片段進行高通量測序。

（3）RNA-RNA pull-down

作者用Ldlr mRNA的互補序列探針進行pull-down實驗釣取細胞的Ldlr Mrna，然后用m6A抗體進行WB檢測pull-down產(chǎn)物，表明Ldlr Mrna上含有m6A富集。CTL探針的pull-down產(chǎn)物作為對照。

文獻原文：Kate D. Meyer,Yogesh Saletore,PaulZumbo,et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in3' UTRs and Near Stop Codons[J].Cell, 2012,149(7): 1635–1646