microRNA調(diào)控m6A RNA甲基化文獻解讀

日期：2020-03-05 標簽：m6A

 m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency

摘要：m6A目前已經(jīng)被確認為真核生物mRNA保守性的表觀修飾，但是其在細胞“重新編程”過程中的特點、調(diào)控機制和功能還了解的很少。本文通過比較分析基因和細胞特異性的mRNAm6A甲基化的幾個特點，揭示了4種不同分化程度的多功能細胞mRNA的m6A修飾。

另外，本文還展示了microRNA通過堿基互補調(diào)控RNA的m6A修飾，miRNA的表達或序列通過METTL3結(jié)合到mRNA的miRNA結(jié)合位點上改變mRNA的甲基化水平。m6A水平的增加促進小鼠纖維母細胞向多功能干細胞分化，而m6A水平的降低則阻礙分化。這些結(jié)果揭示了microRNA在Mrna甲基化上的一種功能，為未來研究m6A在細胞“重新編程”過程中的功能提供新的依據(jù)。

1、meRIP-sep分析：m6A在mRNA的microRNA結(jié)合位點上富集

為了探究m6A的序列特點，作者通過meRIP-seq的方法對所有細胞類型進行了m6A位點的分析，發(fā)現(xiàn)所有類型細胞有87%的M6A峰值位于GGACU上；在包含m6A的序列中有67%–89%與miRNA序列的5’端能進行反向互補，說明這些位點可能是microRNA的結(jié)合靶標位點。如下圖：

圖注：A是各種類型細胞中m6A峰值富集的共同motif序列；B是共同的m6A motif與相應(yīng)microRNA的互補配對情況；C是另外兩種m6A富集的Motif與相應(yīng)microRNA互補配對的情況；D是microRNA靶標的m6A富集的motif的百分比。

2、microRNA通過影響METTL3與mRNA的結(jié)合，影響M6A水平。

（1）Dicer敲低使m6A水平下降，dicer過表達使m6A水平上升。

為了探究microRNA對m6A修飾是否產(chǎn)生影響，作者分別對小鼠NSC和人Hela細胞的dicer酶（對ciroRNA前體加工使其形成成熟miroRNA的限制性內(nèi)切酶）進行過表達和敲低處理后，對細胞總RNA進行m6A dot blot檢測m6A的相對含量，同時WB檢測甲基化酶METT3和去甲基化酶FTO的表達，表明dicer酶過表達后RNA的m6A含量升高dicer酶敲低后RNA的m6A含量降低，而與甲基化相關(guān)的修飾沒表達并不受影響，說明RNA的m6A修飾受dicer酶表達水平的影響。如下圖：

圖注：A和B是dicer酶過表達后的m6A dotblot檢測RNA的m6A含量和WB檢測甲基化相關(guān)的修飾酶；C和D是dicer酶敲低后的m6A dot blot檢測RNA的m6A含量和WB檢測甲基化相關(guān)的修飾酶。

（2）microRNA促進mRNA的甲基化

為了探究microRNA是否調(diào)控m6A的形成，作者從與m6A富集的mitif配對的MicroRNA中隨機選擇幾種MicroRNA在小鼠NSC細胞中進行過表達和敲低后Q-PCR檢測m6A的含量，表明microRNA過表達使m6A升高，microRNA敲低后m6A含量降低。說明microRNA對m6A的形成具有促進作用。如下圖：

圖注：A為隨機選擇的幾種microRNA在小鼠NSC細胞中過表達后Q-PCR檢測相應(yīng)mRNA的m6A形成情況；B為microRNA在小鼠NSC細胞中敲低后Q-PCR檢測相應(yīng)mRNA的m6A形成情況。說明microRNA促進其靶標mRNA的m6A修飾。

（3）microRNA通過介導METTL3與mRNA結(jié)合促進RNA的m6A修飾

上面的研究表明microRNA促進mRNA的甲基化修飾，于是作者推測microRNA通過介導RNA甲基化修飾酶METTL3結(jié)合到mRNA上進行m6A修飾。為了驗證這個猜想，作者首先檢測dicer的表達是否會影響METTL3的細胞定位和功能，通過核質(zhì)分離實驗檢測表明dicer的表達不會影響METTL3的細胞分布；隨后作者通過CLIP驗證microRNA對mRNA與METTL3結(jié)合的影響，dicer酶敲低使得METTL3與mRNA的結(jié)合降低。如下圖：

圖注：A是核質(zhì)分離實驗檢測METTL3的細胞定位和分布；B和C是dicer酶敲低后用帶Myc標簽抗體進行的CLIP實驗，表明dicer敲低后METTL3與RNA結(jié)合降低。

 接著為了更直接的說明microRNA對METTL3和mRNA結(jié)合的影響，作者通過METTL3的RIP-QPCR檢測microRNA過表達后mRNA與METTL3的結(jié)合，說明microRNA對METTL3與mRNA的結(jié)合具有促進作用。如下圖：

圖注：對幾種microRNA進行過表達后，用METT3抗體進行RIP獲取與METTL3結(jié)合的RNA,然后q-pcr檢測相應(yīng)結(jié)合的mRNA，表明microRNA對METTL3與mRNA結(jié)合有影響。

3、m6A的活躍促進細胞的“重新編程”功能

 為了研究m6A對細胞功能的影響，作者分別對METTL3進行過表達和敲低使m6A修飾增加和降低后檢測細胞的干性分化情況：檢測干性相關(guān)基因表達。表明m6A修飾與細胞干性正相關(guān)。

圖注：分別對METTL3進行過表達和敲低后檢測干性相關(guān)基因的表達情況。

文獻原文：TongChen,Ya-Juan Hao,YingZhang,et al.m6A RNA Methylation Is Regulated by MicroRNAsandPromotes Reprogramming to Pluripotency[J].Cell Stem Cell,2015,16,289–301