m6A修飾如何驅(qū)動(dòng)circRNA翻譯

日期：2020-03-05 標(biāo)簽：m6A

Extensive translation ofcircular RNAs driven 

by N6-methyladenosine

circRNA的甲基化修飾驅(qū)動(dòng)其翻譯為蛋白

文獻(xiàn)影響因子：15.6

文獻(xiàn)摘要：人類轉(zhuǎn)錄組大量的mRNA前體異常剪切形成環(huán)狀RNA（circRNA）。本文報(bào)道的是人類細(xì)胞中RNA的堿基修飾m6A促進(jìn)circRNA的蛋白翻譯。本文研究發(fā)現(xiàn)circRNA上的m6A富集的motif是一致的，單一的m6A位點(diǎn)也能夠驅(qū)動(dòng)辭circRNA翻譯開始。這種m6A驅(qū)動(dòng)的翻譯受熱刺激上調(diào)，需要翻譯起始因子eIF4G2和m6A“閱讀器” YTHDF3的輔助，并且受甲基化酶METTL3/14促進(jìn)，受去甲基化酶FTO抑制。更深入的數(shù)據(jù)庫分析和質(zhì)譜分析顯示m6A驅(qū)動(dòng)的circRNA翻譯是廣泛存在的，有大約幾百種circRNA具有翻譯為蛋白質(zhì)的潛能。本文的研究擴(kuò)展的人類轉(zhuǎn)錄組編碼的范圍，揭示了circRNA在環(huán)境刺激后細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的一種功能。

1、細(xì)胞內(nèi)包含m6A motif的circRNA被翻譯為蛋白

之前的研究報(bào)道了一種包含斷裂的GFP的微小基因表明circRNA能用病毒的IRES進(jìn)行翻譯，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種現(xiàn)象，作者分析了在人類基因組中包含其他內(nèi)源性IRES或控制序列的circRNAs是否也能被翻譯，表明IRESs在circRNAs上促進(jìn)翻譯的啟動(dòng)（圖B）。為了了解circRNA翻譯調(diào)控機(jī)制，作者檢測(cè)了這些circRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的序列發(fā)現(xiàn)這些序列的編碼起始位點(diǎn)附近都包含了一個(gè)m6A修飾的RRACH序列片段(R= G or A; H = A, C or U)。與正常編碼的MRNA相比，這些推斷的m6A修飾位點(diǎn)在已知的circRNA上也有明顯的富集。因?yàn)閙6A最近被發(fā)現(xiàn)增加了mRNA的翻譯效率，作者猜想含有RRACH序列的m6A可能涉及到circRNA的翻譯起始。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，作者在circRNA編碼起始位點(diǎn)前插入了一個(gè)包含m6A修飾motif不同副本的短片段(19 nt)并檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)，表明只要有一個(gè)m6A修飾motif存在，circRNA的翻譯就會(huì)明顯增強(qiáng)（圖D）。

圖注：A，病毒IRES介導(dǎo)的circRNA翻譯示意圖；B，circRNA的翻譯可以由不同的內(nèi)源性人類IRESs推動(dòng)；C，mRNA和circRNA的m6A motif分布；D，含m6A修飾motif不同副本的circRNA翻譯檢測(cè)，說明m6A motif直接推動(dòng)circRNA的翻譯。

2、circRNA的m6A甲基化水平影響蛋白翻譯的效率

（1） FTO去甲基化抑制circRNA翻譯，mettl3/14甲基化酶促進(jìn)circRNA翻譯

為了進(jìn)一步的檢測(cè)m6A修飾在circRNA翻譯中的重要性，作者分別將FTO和METTL3/14與circRNA RSV共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后用meRIP-qpcr檢測(cè)circRNA的m6A修飾和WB檢測(cè)circRNA的翻譯水平，表明了TFO使circRNA的m6A修飾水平降低并且抑制circRNA的翻譯，而METTL3/14使circRNA的m6A修飾水平升高并且促進(jìn)circRNA的翻譯。

圖注：A，meRIP-QPCR檢測(cè)circRNA的m6A修飾水平，表明FTO使circRNA RSV的m6A修飾降低；B，WB檢測(cè)circRNA RSV的翻譯水平，表明FTO抑制circRNA RSV的翻譯；C，meRIP-QPCR檢測(cè)circRNA的m6A修飾水平，表明METTL3/14使circRNA RSV的m6A修飾升高；D，WB檢測(cè)circRNA RSV的翻譯水平，表明METTL3/14促進(jìn)circRNA RSV的翻譯。

（2）  熱刺激促進(jìn)circRNA翻譯

腺苷的甲基化作用已被證實(shí)在熱沖擊應(yīng)力下影響mRNA的翻譯，作者在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行42℃熱刺激后檢測(cè)circRNA RSV的翻譯水平，表明circRNA與mRNA一樣在熱刺激時(shí)翻譯增加。這個(gè)結(jié)果表明m6A介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯，特別是來自circRNA，可能是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)重要因素。

圖注：細(xì)胞在通過42℃處理不同時(shí)間后分別檢測(cè)circRNA RSV的RNA水平和翻譯的蛋白水平，表明熱刺激促進(jìn)circRNA RSV翻譯。

3、m6A發(fā)起的circRNA翻譯需要蛋白因子的輔助

真核生物的mRNA翻譯通過eIF4復(fù)合體起始，eIF4E與mRNA的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，同時(shí)eIF4G作為一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合的支架來裝配起始復(fù)合物，通過對(duì)eIF3和eIF4G的結(jié)合激活40S核糖體亞基。在非帽子依賴的翻譯中，在沒有eIF4E的情況下，非常規(guī)的eIF4G蛋白質(zhì)(eIF4G2)直接識(shí)別IRES啟動(dòng)eIF4復(fù)合體裝配。

圖注：真核細(xì)胞中帽子結(jié)構(gòu)依賴性和非帽子結(jié)構(gòu)依賴性的翻譯起始的原理圖，在帽子結(jié)構(gòu)依賴性翻譯中eIF4復(fù)合體識(shí)別m7G并將43S復(fù)合體結(jié)合到mRNA中開始翻譯；非帽子結(jié)構(gòu)依賴性的翻譯中eIF4G2直接與mRNA結(jié)合，并將43S復(fù)合物結(jié)合到mRNA中開始翻譯。

  為了驗(yàn)證circRNA翻譯是否需要輔助的蛋白因子，作者分別對(duì)翻譯起始因子eIF4G2和eIF3A 進(jìn)行敲低處理后檢測(cè)circRNA 的翻譯，表明eIF4G2和eIF3A 敲低后circRNA 的翻譯降低，線性mRNA翻譯不受影響，eIF4G2過表達(dá)后，circRNA翻譯增加而線性mRNA的翻譯也不受影響，說明circRNA的翻譯可能是由一種類似于其他IRESs的eIF4G2機(jī)制啟動(dòng)的。另外，作者分別檢測(cè)了m6A“閱讀”蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3敲低后的circRNA和線性mRNA的翻譯，表明YTHDF1對(duì)circRNA的翻譯無影響，YTHDF2對(duì)circRNA和線性mRNA的翻譯都有影響，而YTHDF3對(duì)circRNA翻譯有影響而不影響線性mRNA的翻譯，說明YTHDF3對(duì)m6A驅(qū)動(dòng)的circRNA翻譯十分重要。eIF4G2和YTHDF3的相互免疫共沉淀反應(yīng)表明它們直接結(jié)合（下圖A），說明可能是YTHDF3招募eIF4G2結(jié)合到m6A修飾的circRNA上。

圖注：將分別用Flag和HA標(biāo)記eIF4G2和YTDHF3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，再分別用Flag和HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行co-IP實(shí)驗(yàn)，表明eIF4G2和YTDHF3相互結(jié)合。

4、包含m6A的內(nèi)源性circRNA的鑒別

為了評(píng)估m(xù)6A介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)circRNA翻譯的重要性,作者通過circRNA-m6A-seq（RNase R處理后的m6A免疫共沉淀）統(tǒng)計(jì)包含m6A的內(nèi)源性circRNA，鑒別出了85個(gè)包含m6A的circRNA，作者進(jìn)一步用circRNA特異引物進(jìn)行RT-PC驗(yàn)證了其中的8個(gè)含m6A的circRNA（圖A）。通過比較分析，所有的m6A位點(diǎn)和eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)富集在假定的circRNA編碼起始AUG附近（圖B）。

圖注：A，用q-pcr檢測(cè)m6A抗體進(jìn)行免疫共沉淀的circRNA，表明選取的circRNA具有m6A修飾；B，m6A和eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)在circRNA上的分布；C，用RNase R處理和不用RNaseR處理的meRIP-seq結(jié)果中每百萬總reads中所含的circRNA的reads。

文獻(xiàn)原文：YunYang,Xiaojuan Fan,MiaoweiMao,et al.Extensivetranslation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J].Cell Research,2017,10.1038/cr.2017.31