RIP實(shí)驗(yàn)常見問題

日期：2015-01-07 標(biāo)簽：RIP實(shí)驗(yàn)常見問題

1：RIP試驗(yàn)需要注意什么？

（1）防止RNA與蛋白非特異性結(jié)合。（2）避免RNA蛋白質(zhì)結(jié)合被破壞。

（3）避免外源RNase污染。        （4）抑制內(nèi)源RNase的活性。

（5）選擇適合做RIP的抗體。      （6）避免RNA結(jié)合蛋白的降解。

2：為什么抗體無(wú)法沉淀RIP裂解液中的目標(biāo)蛋白？

（1）先進(jìn)行IP或者WB，測(cè)試抗體可以與目標(biāo)RBP結(jié)合。

（2）另選一個(gè)能與抗原其他表位結(jié)合的抗體。

（3）盡可能選用密理博RIPAb⁺抗體。

（4）稀釋抗體成濃度梯度，進(jìn)行IP測(cè)試。

（5）4℃過夜孵育抗體與RIP裂解液。

（6）確定抗體類型與Protein A/Protein G匹配。

3：提取RNA時(shí)，蛋白酶K消化不完全是什么原因？

當(dāng)進(jìn)行蛋白酶K消化時(shí)，確保水浴溫度應(yīng)設(shè)置在55℃左右，長(zhǎng)期在65℃以上孵育會(huì)導(dǎo)致蛋白酶K失活。

4：提取RNA后，A260/A280比值偏離1.8~2.2區(qū)域是什么原因？

（1）需要縮短酚氯仿提取RNA的時(shí)間間隔。

（2）測(cè)試提純后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA發(fā)生了降解。

5：做RIP的時(shí)候和beads孵育的lysate的濃度如何確定？有些動(dòng)物的文獻(xiàn)提到用細(xì)胞板數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，想知道如果用蛋白濃度的話，大概在什么數(shù)量范圍的蛋白總量對(duì)應(yīng)50 ul BEADS?

50 μl beads對(duì)應(yīng)的是一個(gè)reaction，而我們推薦一個(gè)reaction是100μl裂解上清（2×107 cells加入100μl RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前計(jì)數(shù)一下，并按括號(hào)中的比例加入裂解buffer，后續(xù)100 μl 裂解上清就是一個(gè)reaction的蛋白用量。不建議通過裂解后測(cè)蛋白濃度的方法進(jìn)行配比。

6：RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物嗎？

理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。但需要特別注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

7：因?yàn)?/span>RIP做完得到的是RNA序列，要做后續(xù)檢測(cè)，比如測(cè)序、判斷目標(biāo)序列位置等，是不是都必須要做RT-PCR，得到逆轉(zhuǎn)錄的DNA后，后面就跟ChIP相同了？

常見的用real time qRT-PCR。如果對(duì)照的目的是保證兩個(gè)樣品間加入的細(xì)胞量一致或者進(jìn)行定量，理論上說，使用input作為判別，計(jì)算不同樣品上樣量的差異。如果對(duì)照的目的是為了看IgG以及目的抗體富集的非特異性mRNA的量的話，那么可以找一個(gè)確定不會(huì)與目的抗體結(jié)合的RNA片段設(shè)計(jì)primer進(jìn)行qPCR，用來(lái)看IgG以及目的抗體拉下來(lái)的背景情況。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對(duì)不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等）