LncRNA的一般研究策略

日期：2019-03-26 標(biāo)簽：LncRNA的一般研究策略

圖1 LncRNA的一般研究策略

（1）LncRNA篩選

通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進(jìn)行lncRNA表達(dá)譜分析；通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測lncRNA的靶基因；通過PCR或Northern Blot技術(shù)對候選lncRNA驗(yàn)證，確定其表達(dá)差異。

（2）LncRNA全長克隆

可以通過5'RACE獲取lncRNA 5'全長，3'RACE獲取lncRNA 3'全長，最終拿到完整的lncRNA序列。

（3）表達(dá)分析

細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測表達(dá)差異。

組織分布：檢測不同組織、不同階段表達(dá)特性。

表達(dá)水平動力學(xué)變化：比較不同處理條件下，如藥物處理、誘導(dǎo)處理下，表達(dá)水平差異。

（4）功能研究

功能獲得性研究：構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體。

功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預(yù)       lncRNA后檢測其對疾病相關(guān)基因表達(dá)影響和對細(xì)胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響。

可通過RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。

表達(dá)調(diào)控：將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋lncRNA調(diào)控機(jī)理。

轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。

染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀調(diào)控。

ceRNA機(jī)制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調(diào)控機(jī)制。

2 LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段

圖2 LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段

（1）與蛋白質(zhì)的相互作用

識別lncRNA的蛋白質(zhì)伙伴，可以為它們的功能的機(jī)制和路徑提高線索。RIP技術(shù)，如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗體來pulldown核蛋白復(fù)合物，然后從中分離相關(guān)RNA用于分析。每個變體都有它各自的優(yōu)勢和缺陷。nRIP提供交聯(lián)產(chǎn)物，而CLIP在避免交聯(lián)產(chǎn)物的重新組合的同時用于識別RNA與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。這些技術(shù)可以結(jié)合高通量測序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，來識別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質(zhì)因子，盡管還需要技術(shù)手段的確認(rèn)。

（2）與DNA的相互作用

有幾個實(shí)驗(yàn)技術(shù)被用于識別lncRNA的基因組靶位點(diǎn)。以染色體免疫共沉淀（ChIP）和RIP技術(shù)的原理為基礎(chǔ)，使用染色體RNA免疫共沉淀（ChRIP）來識別與特殊染色體標(biāo)簽相互作用的RNA。另一方面，chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸來識別與目的RNA相互作用的DNA位點(diǎn)。

圖3 ChIRP基本實(shí)驗(yàn)流程

（3）結(jié)構(gòu)特征

lncRNA可以形成特殊的二級和三級結(jié)構(gòu)來執(zhí)行它們的功能。通過selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing來獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，連接其它依賴于RNA酶消化的技術(shù)，如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。