AGO2在miRNA研究中的應(yīng)用

日期：2019-03-26 標(biāo)簽：AGO2在miRNA研究中的應(yīng)用

AGO蛋白在miRNA通路中發(fā)揮多種功能。它們通過(guò)產(chǎn)生ac-pre-miRNA，參與了miRNA裝配的過(guò)程，同時(shí)它們是RISC效應(yīng)器蛋白，介導(dǎo)mRNA降解、去穩(wěn)定作用或者轉(zhuǎn)錄抑制。另外，AGO2蛋白可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控調(diào)節(jié)miRNA豐度，內(nèi)源性Ago2的減少會(huì)降低成熟miRNA的表達(dá)和活性。Ago2的這個(gè)特殊功能是獨(dú)立于它的剪切功能及內(nèi)切酶活性的。

1 人類(lèi)AGO2蛋白

圖1 人源AGO2基因染色體及cDNA結(jié)構(gòu)圖

盡管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi結(jié)構(gòu)域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，人體內(nèi)4中AGO蛋白（EIF2C1/hAGO1，EIF2C2/hAGO2，EIF2C3/hAGO3，EIF2C4/hAGO4）中，只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。進(jìn)一步研究顯示，RNase H酶的活性位點(diǎn)包括一個(gè)天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽鏈（Asp-Asp-Glu/Asp motif），正是這段肽鏈與Mg²⁺結(jié)合。人體AGO1及AGO4蛋白中的肽鏈都和這段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-組氨酸肽鏈不同，而AGO3雖然擁有相同的保守肽鏈，在體外實(shí)驗(yàn)中同樣未表現(xiàn)出剪切活性。體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)突變改變?nèi)梭wAGO2這段保守序列后，AGO2失去剪切活性。

表1 基因沉默中可能與AGO2相互作用的蛋白

為得到AGO2蛋白具有剪切功能的直接證據(jù)，Meister構(gòu)建了EGFP標(biāo)記的報(bào)告基因。將此報(bào)告基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。向此細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染與報(bào)告基因的3’-UTR互不配對(duì)的全長(zhǎng)miR16。一段時(shí)間培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR16）Hela細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光明顯減弱，對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染miR16）熒光無(wú)明顯變化，證實(shí)EGFP標(biāo)記的此報(bào)告基因可被miR16抑制表達(dá)。選取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，分別敲除AGO1-4。與未敲除細(xì)胞相比，敲除AGO1/ AGO3/ AGO4組細(xì)胞熒光表達(dá)無(wú)明顯變化；敲除AGO2組細(xì)胞熒光表達(dá)明顯上調(diào)。證實(shí)在miRNA介導(dǎo)的對(duì)靶mRNA的降解過(guò)程中，只有AGO2具有剪切活性，能夠剪切mRNA。

2 AGO2影響miRNA作用的發(fā)揮

（1）AGO2參與miRNA裝配過(guò)程

在細(xì)胞核中，RNA合成酶II或III產(chǎn)生Pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本，接著Drosha-DGCR8復(fù)合物對(duì)pri-miRNA進(jìn)行剪切，獲得的前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)，pre-miRNA，被Exportin-5-Ran-GTP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。RNA酶Dicer與雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP的復(fù)合物剪切pre-miRNA 為它的成熟長(zhǎng)度。成熟miRNA的功能鏈被Ago2裝配到RNA介導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC上，它引導(dǎo)RISC，通過(guò)mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄抑制或脫腺苷化對(duì)靶mRNA進(jìn)行沉默，而信使鏈則被分解。

圖2 miRNA生產(chǎn)過(guò)程的“線(xiàn)性化”經(jīng)典途徑

（2）AGO2的修飾調(diào)節(jié)AGO2的活性機(jī)制

在細(xì)胞應(yīng)激條件下，人AGO2蛋白可以在Ser387殘基被p38 MAP激酶磷酸化有助于AGO2定位到處理器processing bodies上。P-bodies是非轉(zhuǎn)錄mRNA和與mRNA翻轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的多種酶系的累積場(chǎng)所，包括AGO2蛋白和miRNAs。

圖3 miRNA生產(chǎn)過(guò)程因子的調(diào)控

（3）RISC裝配復(fù)合物（RLC）：Dicer、TRBP和PACT與AGO2的連接

RISC是miRNA通路的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)器，包括一個(gè)單鏈miRNA將它引導(dǎo)至其靶mRNA。細(xì)胞質(zhì)miRNA的處理和RISC的裝配都是被RLC所介導(dǎo)。RLC是一個(gè)多蛋白復(fù)合物，包括RNase Dicer、雙鏈RNA結(jié)合蛋白復(fù)合物TRBP（Tar RNA binding protein）和PKR的蛋白激活物PACT，其核心組分為AGO2，介導(dǎo)RISC作用于mRNA靶位點(diǎn)。

Dicer和TRBP相互作用，而后被Ago2招募，形成三體復(fù)合物，結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)的pre-miRNA組成RISC裝配復(fù)合物RLC。

圖4 Dicer、TRBP與AGO2的連接

（4）AGO2介導(dǎo)pre-miRNA的剪切：ac-pre-miRNA

由于miRNA的發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)上序列互補(bǔ)程度非常高，在Dicer介導(dǎo)的序列剪切之前需要一個(gè)額外的內(nèi)切核苷酸的剪切步驟：AGO2的剪切功能被激活，剪切發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’ 臂——預(yù)期為信使鏈的中間，得到一個(gè)帶缺口的發(fā)夾架構(gòu)，產(chǎn)生AGO2-剪切的miRNA前體或稱(chēng)為ac-pre-miRNA。Dicer處理這個(gè)前體和pre-miRNA的效率是一樣的。

圖5 AGO2介導(dǎo)pre-miRNA的剪切

3 AGO2的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

AGO2是RISC的核心組分，聯(lián)系著miRNA和它們的mRNA靶位點(diǎn)。因此，在合適的條件下對(duì)AGO2的免疫純化（IP）可以獲得相互結(jié)合的miRNA和mRNA，從而識(shí)別miRNA的靶位點(diǎn)。還可以進(jìn)行免疫熒光，檢測(cè)三者復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位。

圖6 結(jié)合AGO2的RNA的系統(tǒng)分選與鑒定