miRNA的一般研究策略

日期：2019-03-26 標(biāo)簽：miRNA的一般研究策略

miRNA也稱微RNA、microRNA，是真核生物中廣泛存在的一種長(zhǎng)度為21-23nt的RNA分子，可通過(guò)與mRNA的結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。

圖1 miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段

1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因

要對(duì)miRNA進(jìn)行研究，首先需要采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因位點(diǎn)，即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。

2 靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果確認(rèn)

進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)之后，接著是要通過(guò)miRNA pulldown方法，識(shí)別靶基因位點(diǎn)。其中，有以下三種常用的pull-down方法：

（1）生物素化的miRNA pull-down（biotinylated miRNA pull-down）。通過(guò)生物素標(biāo)記的合成miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育后裂解細(xì)胞，用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

圖1 miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段

1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因

要對(duì)miRNA進(jìn)行研究，首先需要采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因位點(diǎn)，即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。

2 靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果確認(rèn)

進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)之后，接著是要通過(guò)miRNA pulldown方法，識(shí)別靶基因位點(diǎn)。其中，有以下三種常用的pull-down方法：

（1）生物素化的miRNA pull-down（biotinylated miRNA pull-down）。通過(guò)生物素標(biāo)記的合成miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育后裂解細(xì)胞，用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

圖2 生物素化的miRNA pull-down

（2）標(biāo)記的miRNA pull-down（labeled microRNA pull-down assay，LAMP），通過(guò)用地高辛（DIG）標(biāo)記的pre-miRNA寡核苷酸與細(xì)胞提取物混合孵育，用抗地高辛的抗體做免疫共沉淀（IP），獲得被共沉淀的mRNA。

（3）核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量測(cè)序（Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis，RIP-Chip，RIP-seq），通過(guò)用合成的miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育后裂解細(xì)胞，用特異的抗AGO2抗體對(duì)RISC進(jìn)行免疫共沉淀，對(duì)獲得的mRNA進(jìn)行microarray分析。

圖3 RIP-Chip基本實(shí)驗(yàn)流程

3 miRNA的直接功能確認(rèn)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證miRNA是否能特異結(jié)合靶mRNA并特異抑制其表達(dá)。

（1）3’-UTR reporter assay

通過(guò)在報(bào)告基因如熒光素酶CDS的下游3’-UTR區(qū)域插入待確認(rèn)的目的基因，克隆到載體如psiCHECK-2上，載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再用miRNA進(jìn)行處理，如果目的基因上含有靶位點(diǎn)，則熒光素酶的轉(zhuǎn)錄受到抑制不發(fā)熒光。

圖4  3’-UTR報(bào)告基因基本實(shí)驗(yàn)流程

圖5  3’-UTR報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA直接作用情況

（2）miRNA的上調(diào)與下調(diào)

通過(guò)人工合成miRNA模擬物（miRNA mimics）或miRNA抑制物（miRNA inhibitor），增強(qiáng)或抑制miRNA的抑制效果，并與對(duì)照相比。

圖6 miRNA的上調(diào)與下調(diào)驗(yàn)證miRNA直接作用情況

（3）位點(diǎn)定向突變（site-directed mutagenesis）

首先，將待測(cè)基因反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)用致突變的引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增；然后，用相關(guān)的酶（一般為Kinase-Ligase-DpnI）對(duì)cDNA模板進(jìn)行消化，克隆到報(bào)告基因載體；最后，將構(gòu)建好的克隆轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。若表達(dá)顯著下降，可表明靶位點(diǎn)定位準(zhǔn)確。

圖7 位點(diǎn)定向突變基本實(shí)驗(yàn)流程

4 miRNA的整體功能驗(yàn)證

對(duì)miRNA的上調(diào)/下調(diào)，通過(guò)Western Blot或其他生物學(xué)通路分析實(shí)驗(yàn)，探究miRNA最終是如何影響細(xì)胞、疾病等等情況。

5 miRNA的定量和定位

通過(guò)RT-qPCR、原位雜交（in situ hybridization）、microarray等實(shí)驗(yàn)手段，確定miRNA的具體表達(dá)量及其所在位置，以明確補(bǔ)充其機(jī)理研究。