鑒于最近在癌癥中靶向染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子方面的成功，作者基于CRISPR-cas9技術(shù)在PTEN敲除的22RV-1細(xì)胞及PTEN未敲除的22RV-1細(xì)胞進(jìn)行了高通量測序篩選，以鑒定PTEN缺失的PCa細(xì)胞中特別需要的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子。該篩選的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子文庫中包含517個(gè)基因，分別編碼表觀遺傳的書寫、擦除和識別。高通量測序初篩分別鑒定出PTEN-complete和PTEN-KD細(xì)胞中分別有47個(gè)和65個(gè)基因跟細(xì)胞生長相關(guān)，其中兩種細(xì)胞類型中有33個(gè)基因重疊(圖1C)，表明無論P(yáng)TEN水平如何，這些基因可能對PCa細(xì)胞的生長都很重要。接下來，為了識別對PTEN缺陷腫瘤重要的表觀遺傳調(diào)控因子，作者將重點(diǎn)放在另外32個(gè)基因上，并使用單個(gè)siRNAs進(jìn)行驗(yàn)證篩選，以比較PTEN敲除與否對22RV-1細(xì)胞的影響。MTT分析結(jié)果顯示，BRG1是差異是最明顯的(圖1D)。BRG1敲除明顯導(dǎo)致了PTEN-WT與PTEN-KD細(xì)胞的預(yù)期差異(圖1D)。在對照中，SF3B1和DDX18等基因沒有表現(xiàn)出這種選擇性。有趣的是，多種SWI/SNF組分(如SMARCE1、SMARCA5等）在PTEN-KD細(xì)胞中均有預(yù)期差異，這表明SWI/SNF復(fù)合物可能對這些細(xì)胞具有生長優(yōu)勢。BRG1是SWI/SNF染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的酶亞基，可以被小分子抑制劑調(diào)節(jié)，因此作者選擇BRG1進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

為了評價(jià)BRG1在前列腺癌中的臨床意義，作者使用預(yù)先驗(yàn)證的BRG1抗體開展了免疫組組化，免疫組化的樣本自于由122個(gè)的亞洲根治性前列腺切除術(shù)組織芯片(TMA)。前列腺標(biāo)本檢查結(jié)果顯示腫瘤組織中BRG1表達(dá) (均數(shù)為4.8;n = 122)較正常組織高(均值為3.2;n BRG1免疫染色強(qiáng)度與腫瘤中Gleason評分和PSA水平呈正相關(guān)。BRG1水平升高的患者生化復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高(P = 0.0004;圖1 f)。作者進(jìn)一步根據(jù)PTEN水平對患者進(jìn)行分層。Kaplan-Meier生存評估分析顯示，BRG1蛋白水平與低PTEN表達(dá)的腫瘤預(yù)后不良呈正相關(guān)(P = 0.010;圖1 g)。而在PTEN高表達(dá)的腫瘤中，BRG1的預(yù)后意義未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.289;圖1 g)。這些結(jié)果提示，在PTEN缺乏的情況下，BRG1的表達(dá)與前列腺腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

為了確定BRG1是否在pten缺乏的PCa細(xì)胞中是特別需要的，作者首先在一組PCa細(xì)胞系中研究了BRG1的功能。作者發(fā)現(xiàn)BRG1表達(dá)的減少顯著降低了PTEN-null PCa細(xì)胞的生長，包括PC3、LNCaP和C4-2細(xì)胞(圖2A)。BRG1 KD未改變PTEN-WT PCa細(xì)胞(22RV-1、BPH-1、LAPC4細(xì)胞)的生長(圖2A)。在不依賴貼壁的生長試驗(yàn)中也證實(shí)了對BRG1的類似依賴性。除22RV-1細(xì)胞外，PC3和LNCaP細(xì)胞中BRG1的缺失嚴(yán)重抑制了菌落的形成。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)PTEN缺失細(xì)胞(PC3和LNCaP細(xì)胞)中PTEN的恢復(fù)使它們對BRG1下調(diào)不敏感。接下來作者研究了BRG1的原致瘤功能是否依賴于其染色質(zhì)重構(gòu)活性。重新表達(dá)野生型的BRG1，能恢復(fù)BRG1缺失細(xì)胞的克隆形成和細(xì)胞遷移缺陷，而缺失atpase的BRG1則無此生物學(xué)功能(圖2B)。

考慮到PCa細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳異質(zhì)性，作者在同一細(xì)胞中單獨(dú)或與同時(shí)敲除PTEN和BRG1。與預(yù)測一致，PTEN KD促進(jìn)細(xì)胞增殖，僅BRG1敲除對22RV-1和LAPC4細(xì)胞的生長無明顯影響(圖2C)。與之形成鮮明對比的是，PTEN KD對BRG1耗竭有明顯的增敏作用。作者發(fā)現(xiàn)PTEN/BRG1雙KD將細(xì)胞生長抑制到基礎(chǔ)水平(圖2C)。這一結(jié)果被皮下成瘤試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明。作者發(fā)現(xiàn)PTEN-KD 22RV-1細(xì)胞更容易受到BRG1敲除的影響，這說明了PTEN和BRG1存在合成致死關(guān)系(圖2D)。從腫瘤體積可以看出，PTEN-KD細(xì)胞中BRG1的耗竭明顯減輕了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。IHC分析表明，在PTEN-KD腫瘤中沉默BRG1導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著減少和凋亡增加。為了進(jìn)一步證明BRG1在PTEN-null PCa中是重要的，作者還進(jìn)行了心臟內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)，以確定BRG1下調(diào)是否抑制了PTEN-null PC3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。生物發(fā)光成像(BLI)顯示，注射BRG1-KD細(xì)胞的小鼠腫瘤細(xì)胞的骨定植明顯減少(圖2E)。與對照組相比，BRG1-KD組骨溶解明顯減少(圖2F)。隨著骨轉(zhuǎn)移的減少(E-cadherin+細(xì)胞)，抗酒石酸磷酸酶(TRAP)陽性染色在BRG1缺失后也隨之減少(圖2G)。綜上所述，這些結(jié)果提示BRG1是pten缺失的PCa細(xì)胞發(fā)生腫瘤所必需的。

為了進(jìn)一步確證BRG1-PTEN在體內(nèi)的關(guān)系，作者利用GEMs來探討B(tài)RG1與PTEN之間的遺傳互作。因此，作者將Brg1fl/fl小鼠與Probasin-Cre (PBCre/+)小鼠雜交，以去除前列腺上皮細(xì)胞中的Brg1 (Brg1PC-/-小鼠)。對6個(gè)月大的Brg1PC-/-小鼠進(jìn)行的前列腺組織學(xué)檢查表明，僅Brg1失活不會導(dǎo)致前列腺葉的病理異常。接下來，作者將Brg1PC - / -小鼠與PtenPC -/-小鼠雜交(簡稱PtenPC-/-;Brg1PC-/-小鼠;圖3A和圖3B)。為了更好地觀察腫瘤的進(jìn)展，化合物小鼠也與Rosa26-LSL熒光素酶報(bào)告小鼠交叉。與PtenPC -/-小鼠相比，五個(gè)月（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠的前列腺生物發(fā)光強(qiáng)度降低了2- 3倍(圖3B)，表明在Pten-null小鼠模型中，BRG1的缺失抑制了腫瘤的進(jìn)展。組織病理學(xué)檢查證實(shí)Brg1的缺乏可抑制Pten-null前列腺腫瘤的進(jìn)展。HGPIN區(qū)域的特征是細(xì)胞核異型性聚集細(xì)胞的粒內(nèi)增殖，與（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠相比，在PtenPC-/-小鼠的前列腺中HGPIN區(qū)域增大(圖3中,C和D)。此外,12只PtenPC-/-小鼠中有3只小鼠發(fā)展成浸潤型腺癌，如圖3e所示，一些腫瘤細(xì)胞突破基質(zhì)細(xì)胞 (SMAα染色)和入侵的前列腺基質(zhì)(雄激素受體(AR)染色,箭頭) 。與此相反，Pten和Brg1失活的小鼠在增生期或低分級PIN (LGPIN)期出現(xiàn)病變，且病變大部分被抑制，外顯性不完全(圖3,C和D)。同樣，（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠未見侵襲性腺癌的發(fā)生 (圖3E)。通過Ki67染色，作者發(fā)現(xiàn)（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠前列腺增生指數(shù)明顯降低?？傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明BRG1對PTEN缺乏引起的前列腺腫瘤的進(jìn)展起關(guān)鍵作用。

為了確定BRG1在PTEN缺陷的腫瘤細(xì)胞中的作用，作者運(yùn)用了類器官培養(yǎng)平臺，類器官培養(yǎng)能大體上模擬前列腺的組織學(xué)特征，包括在基底細(xì)胞中具有核AR表達(dá)和p63表達(dá)的多層結(jié)構(gòu)。作者從（TMPRSS2-CreERT2-IRES-GFP;Ptenfl/fl）小鼠前列腺中分離出管腔細(xì)胞，如前所述。PTEN的缺失通過4-羥基他莫西芬(4-OHT)完成，BRG1通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)被敲除(圖3F)。正如預(yù)測的那樣，PTEN的缺失促進(jìn)了類前列腺器官的形成，而BRG1的缺失并不影響PTEN-WT小鼠的類前列腺器官的起始能力或大小(圖3F)。相比之下,作者發(fā)現(xiàn)BRG1缺失深深地影響了PTEN-deficient小鼠的前列腺類器官形成能力，諸如前列腺類器官的大小和Ki67 +細(xì)胞的數(shù)量(圖3中,F和G)。為了更進(jìn)一步確定BRG1是否是PTEN-deficient腫瘤特異需要的, 作者評估了BRG1 KD在前列腺c-Myc過表達(dá)小鼠的類器官培養(yǎng)中的作用。Myc擴(kuò)增或過表達(dá)常見于人類腫瘤中，因此，該模型可能代表了與不同于PTEN缺失引起的的人類PCa。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)Brg1耗竭并不改變c-Myc過表達(dá)引起的致瘤潛能(圖3H)。接下來，作者研究了其他常見的PCa基因改變，如p53缺失或SPOP多態(tài)，是否會影響PTEN與BRG1的合成致死關(guān)系。為此，作者使用Pten和Tp53雙敲除小鼠(PtenPC -/-;Tp53PC -/-)，發(fā)現(xiàn)BRG1- KD仍能抑制類前列腺器官的生長。同樣，患者來源的SPOP突變體(F133V)在PC3和22RV-1 PTEN-KD細(xì)胞中過表達(dá)也沒有改變BRG1下調(diào)的敏感性。因此，GEMs和類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共同證明了Brg1在pten突變的PCa中的關(guān)鍵和特殊功能。

下一步，作者的目標(biāo)是探索PTEN缺失使細(xì)胞對BRG1耗竭敏感的分子基礎(chǔ)。作者注意到，PTEN-null PCa細(xì)胞(PC3、LNCaP和C4-2細(xì)胞)中的BRG1蛋白水平高于正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1細(xì)胞和小鼠前列腺[mAP])或PTEN-WT PCa細(xì)胞(BPH-1、22RV-1和LAPC4細(xì)胞)(圖4A)。在PtenPC-/-小鼠前列腺中也觀察到類似的結(jié)果。與WT對照組相比，PTEN缺失組前列腺中BRG1蛋白水平(而非mRNA)明顯升高(圖4B)。重要的是，在PC3細(xì)胞中PTEN的重新引入導(dǎo)致了BRG1蛋白的顯著降低，同時(shí)增加了BRG1多泛素化，而不影響B(tài)RG1 mRNA水平(圖4,C和D)。這些觀察結(jié)果表明，PTEN通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來調(diào)控BRG1的表達(dá)。

在PTEN缺失的情況下，最顯著的信號事件是AKT的組成性激活，它影響蛋白酶體依賴蛋白的降解(33,38)。事實(shí)上,作者研究結(jié)果表明通過siRNA-KD或LY294002處理抑制AKT信號通路，降低了BRG1蛋白的穩(wěn)定性但不改變其mRNA水平(圖4中,E和F)。利用 MG132和LY294002共處理細(xì)胞，能阻礙BRG1蛋白的降解(圖4),這就強(qiáng)調(diào)了PTEN缺失激活A(yù)KT軸增強(qiáng)BRG1蛋白的穩(wěn)定性是依賴于蛋白酶體的。AKT磷酸化糖原合成酶kinase-3β(GSK3β)第9位的絲氨酸并抑制其激酶活性(39-41)。因此作者推斷,PTEN缺失增強(qiáng)BRG1的穩(wěn)定性通過降低GSK3β活性來實(shí)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證這種推斷,作者首先證明了在細(xì)胞內(nèi)BRG1能與GSK3β互作(圖4 g)。GST pull-down的結(jié)果分析表明,BRG1羧基端 (aa1300-1647)對BRG1與GSK3β之間的直接聯(lián)系負(fù)責(zé)。從功能上來說, 在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)表達(dá)野生型或者持續(xù)激活的GSK3β(GSK3β-S9A)能縮短BRG1蛋白的半衰期。更重要的是,在AKT敲除的PC3細(xì)胞中，消耗GSK3β能延長BRG1蛋白的半衰期,表明PTEN-AKT穩(wěn)定BRG1蛋白是通過GSK3β來實(shí)現(xiàn)的 (圖4h)?；颊邩?biāo)本分析證實(shí)了PTEN對BRG1的調(diào)節(jié)作用。122個(gè)PCa樣本中BRG1與PTEN蛋白呈負(fù)相關(guān)(r = -0.427, P < 0.0001;圖4)?？傊?作者的結(jié)果表明, 在PCa細(xì)胞中，PTEN/AKT/GSK3β信號軸調(diào)控著BRG1的穩(wěn)定性。因此，在PTEN缺乏的腫瘤中BRG1上調(diào)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞依賴于BRG1的存在。

作者試圖明確PTEN/AKT/GSK3β調(diào)節(jié)BRG1穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。先前的研究已經(jīng)報(bào)道,GSK3β直接磷酸化底物,便于識別后續(xù)的蛋白降解的E3連接酶。有趣的是,共識序列比對發(fā)現(xiàn)在BRG1的羧基端的S1417和S1421位置有一個(gè)進(jìn)化保守的GSK3β磷酸化序列(XpS/TGXXpS/T) (圖5)。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明在HEK293細(xì)胞BRG1的S1417和S1421位點(diǎn)均被磷酸化,且這些磷酸化信號在GSK3β表達(dá)后會進(jìn)一步加強(qiáng)。為了確定GSK3β是否直接磷酸化BRG1,作者進(jìn)行體外激酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,只有野生型的BRG1能被GSK3β有效磷酸化,而突變的BRG1-S1417A/S1421A (BRG1-SA)則不能被磷酸化(圖5 b),這就說GSK3β是直接對BRG1的S1417/1421位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化。作者進(jìn)一步生產(chǎn)了一種抗體，這種抗體可以識別BRG1在S1417/1421位點(diǎn)的磷酸化。重新恢復(fù)PC3細(xì)胞中PTEN的表達(dá)能明顯增強(qiáng)內(nèi)源的phospho-BRG1-S1417/1421水平,而GSK3β激酶抑制劑CHIR-99021處理能極大地削弱了這個(gè)磷酸化(圖5)。值得注意的是,λ-phosphatase處理實(shí)驗(yàn)證實(shí)GSK3β磷酸化BRG1-S1417/1421是特異的(圖5)。

FBXW7和β-TrCP是已知的Skp1-Cullin1-F-box蛋白類的E3泛素連接酶，它們與PTEN/GSK3β-mediated蛋白質(zhì)降解有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)使用siRNA-KD沉默F(xiàn)BXW7極大地增強(qiáng)了BRG1在PCa細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量，但沉默β-TrCP則無此效果。同樣FBXW7過表達(dá)刺激了PC3細(xì)胞中BRG1的多泛素化(圖5D)。與此相應(yīng)地，干擾FBXW7可恢復(fù)AKT缺失細(xì)胞中的BRG1蛋白水平(圖5E)，從而確定了PTEN-AKT和FBXW7調(diào)節(jié)BRG1穩(wěn)定性的因果關(guān)系。接下來,作者進(jìn)行了一次體外泛素化分析實(shí)驗(yàn)來確定是否確實(shí)FBXW7靶向BRG1,使其磷酸化進(jìn)而降解?？狗核乜贵wIB顯示，當(dāng)丙氨酸取代絲氨酸(BRG1-S1417A/S1421A, BRG1-SA)時(shí)，多泛素化的BRG1明顯減少，而模擬磷酸化的BRG1-S1417D /S1421D (BRG1-SD)蛋白比WT蛋白表現(xiàn)出更明顯的多泛素化(圖5F)。同理，外源表達(dá)的BRG1-SD蛋白與WT BRG1蛋白相比具有更高的泛素化轉(zhuǎn)化率，而BRG1-SA在HEK293細(xì)胞中更為穩(wěn)定。作者進(jìn)一步證明了P-S1417/1421-BRG1促進(jìn)了HEK293細(xì)胞中FBXW7與BRG1的直接結(jié)合。同時(shí)BRG1-SA與FBXW7表現(xiàn)出分離狀態(tài)，而模擬磷酸化的BRG1-SD蛋白與FBXW7的結(jié)合則更強(qiáng)(圖5G)。

為了證實(shí)上述觀察的現(xiàn)象，作者利用CRISPR-Cas9技術(shù)將內(nèi)源性BRG1中的S1417/1421替換為PC3細(xì)胞中的Ala或Asp，從而分別生成SA和SD細(xì)胞(見圖5E)。事實(shí)上，BRG1-SD蛋白表現(xiàn)出更明顯的降解和多泛素化，而BRG1-SA比其WT對應(yīng)物則更穩(wěn)定(圖5H)。MG132處理減弱了BRG1-SD蛋白的加速降解效果。隨著SA細(xì)胞中BRG1磷酸化水平的降低，BRG1與FBXW7的結(jié)合減少，而在SD突變體中，BRG1與FBXW7的結(jié)合則增加(圖5I)?？傊?這些結(jié)果表明, GSK3β介導(dǎo)的BRG1-S1417/1421磷酸化促進(jìn)了SCF-FBXW7 E3連接酶對其識別,進(jìn)而導(dǎo)致BRG1降解。在異種移植模型中作者進(jìn)一步評估了BRG1-S1417/1421磷酸化的意義(圖5J)。作者發(fā)現(xiàn)SA細(xì)胞更具有致瘤性，而SD細(xì)胞來源的異種移植物明顯小于WT PC3細(xì)胞來源的異種移植物。進(jìn)一步對PCa標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，30個(gè)PCa標(biāo)本中PTEN與p-S1417/1421水平密切相關(guān)(r = 0.688, P = 5.5×10-5;圖5 K)。此外，BRG1與p-S1417/1421水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.600, P=0.0007;圖5K)。這些結(jié)果都證明PTEN/AKT/GSK3β軸通過FBXW7依賴的泛素蛋白酶體途徑來調(diào)節(jié)BRG1的降解。

為了研究PTEN缺陷腫瘤依賴于BRG1上調(diào)的原因，作者對伴有或不伴有PTEN敲除的BRG1缺失的22RV-1細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。通過對差異表達(dá)基因(DEGs)的聚類分析，作者發(fā)現(xiàn)PTEN/BRG1雙敲除細(xì)胞中5489個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，而這些基因在Control、BRG1- KD和PTEN-KD細(xì)胞中表達(dá)模式明顯不同。與這些結(jié)果一致的是，KEGG-DEG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)表明，PTEN缺失細(xì)胞中的BRG1缺失顯著改變了PCa進(jìn)程、細(xì)胞周期及細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的過程。通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證所選基因的差異表達(dá)，并將結(jié)果匯總成heatmap圖(圖6A)。為了鑒定BRG1介導(dǎo)的下游靶點(diǎn)和通路，作者對對照細(xì)胞和PTEN-KD的22RV-1細(xì)胞進(jìn)行ChIP-Seq分析。PTEN缺失導(dǎo)致BRG1在BRG1峰值的全局占用率增加(圖6B)。PTEN-KD細(xì)胞中共有6279個(gè)基因(67.9%的BRG1結(jié)合基因)表現(xiàn)出比對照細(xì)胞更強(qiáng)的BRG1結(jié)合?？紤]到BRG1是激活核小體的ATP酶的核心亞基，作者推斷PTEN缺陷細(xì)胞中的BRG1敲除可能損害了染色質(zhì)構(gòu)型。為了驗(yàn)證這種可能性，作者進(jìn)行了染色質(zhì)可及性測序(ATAC-Seq)，以比較PTEN-KD和PTEN/BRG1-KD細(xì)胞之間的開放染色質(zhì)區(qū)域(OCS)。全基因組ATAC-Seq強(qiáng)度圖顯示，與完整的BRG1細(xì)胞相比，BRG1敲除的PTEN-KD細(xì)胞中導(dǎo)致了60%以上的OCR減少。與PTEN-KD細(xì)胞相比，PTEN/BRG1-KD細(xì)胞中有60740個(gè)DNA可及性降低的峰(圖6C)。(圖6D)展示的是少數(shù)代表性的染色質(zhì)可及性測序峰圖，其結(jié)果表明BRG1缺失導(dǎo)致ETV-1和cav2基因位點(diǎn)的DNA可達(dá)性降低。總之，作者的結(jié)果表明BRG1的敲除導(dǎo)致了PTEN缺失腫瘤中染色質(zhì)動力學(xué)的顯著變化。

為了鑒定PTEN缺失的PCa中BRG1的可能靶點(diǎn)，作者將BRG1的峰值與OCR和DEGs的變化進(jìn)行比對;其中有553個(gè)基因重疊，這些重疊基因被稱為PTEN依賴性的BRG1信號 (圖6E)。KEGG-Pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些基因與調(diào)控干細(xì)胞多能性的信號、軸突引導(dǎo)、腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)、MAPK信號通路相關(guān)。接下來，作者發(fā)現(xiàn)將PTEN依賴性的BRG1信號通過K 均值聚類分析將患者分成兩組，兩組在生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)上有顯著差異(圖6F)。此外，通過比較PTEN-WT和PTEN-null腫瘤中不同表達(dá)量的基因集，作者發(fā)現(xiàn)PTEN-null腫瘤具有較高的BRG1信號活性。

雖然很難將BRG1功能歸為一個(gè)離散的靶基因，但作者測量了幾個(gè)已知對前列腺腫瘤發(fā)生有重要意義的基因的表達(dá)。選取PCa、MAPK信號中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的代表基因，以及表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，包括c-Myc、ETV-1、NCoA2、ERRB2、FGFR3、K-Ras、Sin3A、BMI1和DOT1L(圖7A)。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)BRG1存在于這些基因位點(diǎn)，這與該亞基在SWI/SNF靶向定位中的直接作用一致(圖7B)。ChIP-qPCR結(jié)果顯示，BRG1缺失顯著降低了c-Myc、ETV-1、K-Ras和BMI1基因位點(diǎn)的H3K9ac水平(圖7B)。由于H3K27ac能區(qū)分活躍的和不活躍的染色質(zhì)(45)，作者一致檢測到在同一位點(diǎn)H3K27me3同時(shí)增加(圖7B)。這些結(jié)果表明BRG1的缺失有利于抑制染色質(zhì)狀態(tài)，從而抑制基因表達(dá)。聚焦于c-Myc和MAPK信號,作者確認(rèn), 與PTEN-deleted細(xì)胞相比，PTEN/BRG1-KD細(xì)胞中c-Myc表達(dá)和p-ERK激活下調(diào)到本底水平在 (圖7中,C和D)。接下來,作者將作者的分析擴(kuò)展到基因工程小鼠，其結(jié)果顯示, 與PtenPC -/-小鼠相比，（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠中c-Myc和p-ERK水平明顯減少 (圖7E)。此外，在前列腺癌患者中，BRG1轉(zhuǎn)錄組與c-Myc和MAPK信號相關(guān)基因密切相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，BRG1重構(gòu)了PTEN缺失的PCa細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并啟動了涉及c-Myc和MAPK信號的原癌基因轉(zhuǎn)錄組，導(dǎo)致細(xì)胞變得依賴于BRG1。

最后，作者使用PtenPC-/-小鼠進(jìn)行了臨床前研究，這些小鼠在2.5個(gè)月大時(shí)隨機(jī)接受溶劑處理或PFI-3處理，這是一個(gè)可以識別PIN的時(shí)間點(diǎn)。MRI結(jié)果顯示，PFI-3處理顯著降低了腫瘤體積(平均腫瘤體積減少約43%)，所有小鼠的病理反應(yīng)接近完全(n = 5;圖8 e)。與溶劑組的腫瘤特征相反，PFI-3處理小鼠的腫瘤特征為增生或LGPIN(圖8F)。一致地， PFI-3抑制劑處理的PtenPC-/-腫瘤顯示ki-67陽性有絲分裂細(xì)胞的頻率急劇下降，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。值得注意的是，PFI-3在小鼠中耐受良好，因?yàn)樗鼪]有造成顯著的體重下降、嗜睡或喂養(yǎng)異常。因此，PFI-3藥物抑制SWI/SNF重構(gòu)復(fù)合物在治療PCa小鼠模型中得到了有益的結(jié)果。