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生信分析文章：比對(duì)染色質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)解析SOX2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞干性維持的作用

日期：2020-03-04 標(biāo)簽：SOX2


Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for SOX2 Function in Neural Stem Cell Maintenance

摘要

    SOX2是一種維持未分化的胚胎干細(xì)胞（ESC）、神經(jīng)干細(xì)胞再生能力及細(xì)胞干性的重要轉(zhuǎn)錄因子。在人類中，SOX2基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致顯性遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如海馬病變、癲癇和學(xué)習(xí)障礙等；在小鼠中SOX2基因突變也會(huì)導(dǎo)致相似的疾病發(fā)生。作者為了確定SOX2在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）中轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用模式，搜集了3種不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體在野生型小鼠和SOX2敲除小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中所產(chǎn)生的ChIA-PET數(shù)據(jù)結(jié)果，聯(lián)合SOX2的ChIP-seq數(shù)據(jù)，以及H3K27ac、H3K4me1的ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SOX2主要通過遠(yuǎn)程調(diào)控啟動(dòng)子與增強(qiáng)子間的互作來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。比對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在SOX2敲除小鼠中的神經(jīng)干細(xì)胞中，啟動(dòng)子與遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的互作能力比正常小鼠弱，SOX2的靶基因表達(dá)水平也下降。隨后，作者選取了SOX2的靶基因SOCS3，在敲除的SOX2的神經(jīng)干細(xì)胞中過表達(dá)SOCS3。NSC的生長(zhǎng)能力和富集能力得到部分恢復(fù)。因此作者提出在NSC中，SOX2主要通過調(diào)節(jié)啟動(dòng)子與遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的互作來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。


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一、     SOX2敲除導(dǎo)致在神經(jīng)干細(xì)胞中遠(yuǎn)程互作減少

作者為了確定神經(jīng)干細(xì)胞中SOX2對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，  分析了不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體在野生型小鼠NSC（wTR1、wTR2 、wTR3）和SOX2敲除小鼠NSC（mTR1、mTR2、mTR3）中所產(chǎn)生的ChIA-PET數(shù)據(jù)結(jié)果，鑒定了RNA pol II在啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)和遠(yuǎn)程互作位點(diǎn)（圖1b）。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在SOX2敲除組（mut）中，無(wú)論是啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)還是遠(yuǎn)程互作位點(diǎn)都比野生組（wt）少（圖1b）。同時(shí)，ChIA-PET結(jié)果顯示在敲除SOX2后，多個(gè)基因的啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作減少（圖1C-G）。這些數(shù)據(jù)表明，SOX2主要通過調(diào)控基因啟動(dòng)子的遠(yuǎn)程互作來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。

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二、     SOX2主要結(jié)合在增強(qiáng)子區(qū)域

為了進(jìn)一步確定SOX2對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，根據(jù)SOX2-ChIP-seq結(jié)果把結(jié)合位點(diǎn)分為TSS結(jié)合點(diǎn)與遠(yuǎn)程結(jié)合點(diǎn)，并分別于H3K27ac+和H3K4me1+的ChIP-seq結(jié)果進(jìn)行比較（圖2a，2b）。H3K27ac+是轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志蛋白，主要標(biāo)示啟動(dòng)子與增強(qiáng)子的位置。H3K4me1+也是轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)志蛋白，主要標(biāo)示增強(qiáng)子位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX2的結(jié)合位點(diǎn)主要在遠(yuǎn)程增強(qiáng)子的位置。（圖2b）。然后作者把遠(yuǎn)程互作模式分為三類：?jiǎn)?dòng)子與遠(yuǎn)程啟動(dòng)子區(qū)域互作模式（P-P）、啟動(dòng)子與遠(yuǎn)程區(qū)域互作模式（P-e）、非啟動(dòng)子間互作模式，比較發(fā)現(xiàn)pol II介導(dǎo)的遠(yuǎn)程結(jié)合模式主要以p-p或p-e為主，約占90%（圖2c）。然后聯(lián)合SOX2-ChIP-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX2的結(jié)合位點(diǎn)主要在p-e模式中（圖2d）。最后， SOX2的ChIP-seq數(shù)據(jù)，以及H3K27ac、H3K4me1的ChIP-seq，3種不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體的ChIA-PET結(jié)果聯(lián)合分析，顯示SOX2的結(jié)合位點(diǎn)主要在遠(yuǎn)程增強(qiáng)子區(qū)域。

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三、     SOX2結(jié)合遠(yuǎn)程增強(qiáng)子調(diào)控與腦部發(fā)育相關(guān)基因

在野生型小鼠NSC和SOX2敲除小鼠中，聯(lián)合pol II的ChIA-PET結(jié)果與SOX-2-ChIP-seq結(jié)果分析SOX2對(duì)下游靶基因的調(diào)控模式，結(jié)果顯示，SOX2在靶基因的遠(yuǎn)程區(qū)域有許多結(jié)合位點(diǎn)，SOX2的敲除對(duì)靶基因的遠(yuǎn)程互作有明顯的抑制作用。因此SOX2主要通過調(diào)控基因遠(yuǎn)程結(jié)合區(qū)域來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。

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四、驗(yàn)證SOX2遠(yuǎn)端結(jié)合區(qū)域是否是增強(qiáng)子

作者為了確定這些遠(yuǎn)程結(jié)合位點(diǎn)是否具有增強(qiáng)子的作用，將SOX2遠(yuǎn)程結(jié)合位點(diǎn)（即遠(yuǎn)程增強(qiáng)子（DA））構(gòu)建到熒光載體的啟動(dòng)子前，并把這些熒光載體導(dǎo)入斑馬魚神經(jīng)干細(xì)胞中，驗(yàn)證SOX2的結(jié)合位點(diǎn)是否是增強(qiáng)子（圖4）。結(jié)果SOX2遠(yuǎn)程結(jié)合區(qū)域均能檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，這說(shuō)明這樣遠(yuǎn)程的結(jié)合位點(diǎn)具有增強(qiáng)子的作用。

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五、與SOX2通過遠(yuǎn)程互作模式對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控

對(duì)NSC細(xì)胞內(nèi)整體的RNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，敲除SOX2后，細(xì)胞整體RNA轉(zhuǎn)錄水平和具有遠(yuǎn)程協(xié)作調(diào)控的相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄水平下降（圖5a）。當(dāng)基因啟動(dòng)子與越多的增強(qiáng)子有互作時(shí)，基因的表達(dá)量越高（圖5b）。接下來(lái)作者比較wt（野生型小鼠）與mut（SOX2敲除型小鼠）神經(jīng)干細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在wt組中的表達(dá)比mut中的高（圖5c）。SOX2敲除，總體基因表達(dá)水平下降。然后對(duì)這些基因根據(jù)結(jié)合模式進(jìn)行分組比較表達(dá)差異（圖5d），結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要是以P-E模式（啟動(dòng)子與遠(yuǎn)程增強(qiáng)子互作模式）互作。綜上所述，在NSC中，SOX2通過遠(yuǎn)程互作模式對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控。

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六、SOX2敲除細(xì)胞系中過表達(dá)Socs3能恢復(fù)NSC生長(zhǎng)活性

SOCS3基因一種JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子，它能抵抗NSC早熟分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)也是SOX2的一個(gè)靶基因。RNA pol II的ChIA-PET結(jié)果與SOX2-ChIP-seq結(jié)果聯(lián)合分析顯示，SOX2在SOCS3基因的啟動(dòng)子及遠(yuǎn)程互作區(qū)域有集合位點(diǎn)，SOX2通過遠(yuǎn)程互作調(diào)控SOCS3基因的表達(dá)（圖6a）。作者在SOX2敲除的神經(jīng)干細(xì)胞中過表達(dá)SOCS3，細(xì)胞的生長(zhǎng)能力得到恢復(fù)（圖6b、6c）。

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    綜上所述，SOX2主要通過介導(dǎo)染色質(zhì)遠(yuǎn)程增強(qiáng)子與靶基因啟動(dòng)子相互作用，對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控。

 

文獻(xiàn)來(lái)源：Bertolini JA, Favaro R, Zhu Y et al. Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for SOX2 Function in Neural Stem Cell Maintenance. Cell Stem Cell. 2019 Mar 7;24(3):462-476.e6. doi: 10.1016/j.stem.2019.02.004.


 





 


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