圖1. HOX蛋白介導(dǎo)的前列腺癌轉(zhuǎn)錄組調(diào)控的競爭模型。

左圖：HOXB13在正常前列腺組織中表達(dá)，與其靶位點結(jié)合并調(diào)節(jié)前列腺轉(zhuǎn)錄組。正常前列腺細(xì)胞中HOXC6的水平非常低，因此該TF對基因調(diào)節(jié)沒有幫助。右圖：HOXC6在前列腺腫瘤中異常表達(dá)，高水平的HOXC6蛋白與HOXB13競爭共同結(jié)合位點的占據(jù)。結(jié)合的HOXC6可能會增加癌基因的表達(dá)（如果它募集了一種共激活因子）或降低腫瘤抑制因子的表達(dá)（如果它募集了共抑制因子）。

    為了研究HOXC家族成員與前列腺癌之間的關(guān)系，作者使用22Rv1細(xì)胞作為模型系統(tǒng)來研究HOXC4和HOXC6。以HOXC4或HOXC6m RNA為靶點，用siRNA進(jìn)行分別敲除和雙敲除，處理后差異表達(dá)的基因火山圖表明，盡管HOXC4和HOXC6都減少了大約相同的量，但受HOXC6敲低影響的基因數(shù)量大于受HOXC4敲減影響的基因數(shù)量（圖1A）。由于兩個TF 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域非常相似，因此，作者還進(jìn)行了HOXC4和HOXC6的雙重敲除，并鑒定了在同時敲除兩個HOXC TF時被解除調(diào)節(jié)的更大基因集（圖1B），表明這些TF具有至少部分冗余的功能。通路分析顯示，HOXC4或HOXC6的siRNA敲低后被下調(diào)的基因與癌癥和細(xì)胞周期有關(guān)（圖1C）

圖2.HOXC6和HOXC4調(diào)控的基因的鑒定。

（A）在siRNA介導(dǎo)的HOXC6、HOXC4或兩者同時敲除后，基因上調(diào)或下調(diào)的火山圖。為便于顯示，這些基因的調(diào)整p值未顯示為刻度；

（B）韋恩圖，比較在敲除HOXC6、HOXC4或兩者同時進(jìn)行的基因下調(diào)（左圖）或上調(diào)（右圖）。

（C）敲除HOXC6/HOXC4后下調(diào)基因的通路分析。

   由于RNA-seq分析表明HOXC4和HOXC6可能具有冗余功能，因此作者接下來想確定它們在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合情況。使用帶有Flag標(biāo)簽的HOXC6和HOXC4蛋白進(jìn)行CHIP-seq分析，HOXC6的CHIP-SEQ分析表明，約73％的HOXC6峰包含典型的富AT的HOX結(jié)合基序，該基序位于峰的中心（圖2A 上）。然后，作者注釋了HOXC6結(jié)合位點相對于它們在特定基因組特征中的位置。發(fā)現(xiàn)HOXC6峰通常位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)域或內(nèi)含子中（圖2A 中）。對HOXC6峰距最近的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的距離進(jìn)行了類似的注解，發(fā)現(xiàn)HOXC6主要結(jié)合到距TSS上游或下游10 kb遠(yuǎn)的調(diào)節(jié)元件上（圖2A 下）。HOXC4的ChIP-seq實驗，確定了位于峰中心的富含AT的基序并且觀察到與HOXC6相似的峰分布，該峰與TSS的距離和基因結(jié)構(gòu)有關(guān)（圖2B）。

圖3.大多數(shù)HOXC4和HOXC6結(jié)合位點都遠(yuǎn)離TSS。

（A）上圖：顯示的是在所有HOXC6結(jié)合位點集中確定的最高等級的從頭基序； 在以HOXC6峰為中心的-/ + 250bp窗口內(nèi)顯示了基序的富集。 中圖：顯示的是HOXC6峰相對于基因結(jié)構(gòu)的位置。 下圖：顯示的是HOXC6峰相對于距最近的TSS的距離的位置。

（B）與（A）圖相同，但是是針對HOXC4結(jié)合位點。

   HOXC4和HOXC6的遠(yuǎn)側(cè)結(jié)合模式表明它們可能是增強(qiáng)子結(jié)合的TF。通常將增強(qiáng)子鑒定為以H3K27Ac標(biāo)記的開放染色質(zhì)區(qū)域。因此，為進(jìn)一步表明HOXC結(jié)合位點，作者使用測序（ATAC-seq）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)座酶處理染色質(zhì)的公開檢測方法確定了HOXC4或HOXC6峰是否位于開放染色質(zhì)區(qū)域。結(jié)果表明大多數(shù)HOXC6和HOXC4結(jié)合位點不在開放染色質(zhì)中（圖3A）。由于大多數(shù)HOXC4和HOXC6結(jié)合位點不在ATAC-seq識別的區(qū)域內(nèi)，這使得作者進(jìn)一步研究了峰的特征。HOXC6和HOXC4的結(jié)合強(qiáng)度在H3K27Ac +或H3K27Ac-峰和ATAC-seq +或ATAC-seq峰處大致相等（圖3B），這表明HOXC6和HOXC4結(jié)合在核小體占據(jù)的染色質(zhì)區(qū)域與無核小體、活性增強(qiáng)子的TFs結(jié)合一樣。

圖4.大多數(shù)HOXC6和HOXC4結(jié)合位點位于核小體占據(jù)的區(qū)域。

（A）顯示了以HOXC6或HOXC4峰的基因組位置為中心的ATAC-seq和H3K27Ac ChIP-seq數(shù)據(jù)的標(biāo)簽密度圖和熱圖。

（B）顯示的是HOXC6和HOXC4峰的標(biāo)簽密度圖，分為H3K27Ac標(biāo)記或未標(biāo)記的組以及ATAC-seq鑒定為或未鑒定為開放染色質(zhì)的位點。

   有研究表明，果蠅中的不同HOX基因可以與相似的基因組位點結(jié)合。為了測試在前列腺癌中上調(diào)的人類HOX基因是否也是如此，作者比較了HOXC6和HOXC4的結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HOXC4結(jié)合位點與HOXC6結(jié)合位點重疊（圖4A）。因為HOXB13 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與HOXC6 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似為73.7％，所以作者用HOXB13抗體，在22Rv1細(xì)胞中進(jìn)行HOXB13 ChIP-seq。發(fā)現(xiàn)37％的HOXB13結(jié)合位點也被HOXC4和HOXC6結(jié)合。HOXC4或HOXC6共共有2321個HOXB13峰（圖4A）。HOXC4，HOXC6和HOXB13共同結(jié)合的峰的特征表明，大多數(shù)共同結(jié)合的位點位于遠(yuǎn)距離基因間隔區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，距離TSS超過10kb（圖4B）。

圖5. HOXC6，HOXC4和HOXB13與一組常見的調(diào)控元件結(jié)合。

（A）顯示的是比較HOXC6，HOXC4和HOXB13結(jié)合位點的三向維恩圖。

（B）上：顯示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共結(jié)合位點相對于基因結(jié)構(gòu)的位置。下：顯示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共結(jié)合位點相對于距最近的TSS的距離的位置。

   因為已有報道HOXB13，F(xiàn)OXA1和AR可以共定位于常見的結(jié)合位點，所以作者將HOXC4和HOXC6結(jié)合位點與FOXA1和AR結(jié)合位點進(jìn)行比較。進(jìn)行了ChIP-seq識別22Rv1細(xì)胞中的FOXA1位點。并使用了兩種不同的FOXA1抗體和IDR確認(rèn)兩種抗體都檢測到相似的結(jié)合位點。作者發(fā)現(xiàn)，HOXC4或HOXC6結(jié)合位點的強(qiáng)度與關(guān)鍵前列腺癌轉(zhuǎn)錄因子HOXB13，F(xiàn)OXA1和AR的結(jié)合位點之間存在顯著的相關(guān)性（圖5A）。然而，只有一個結(jié)合位點的子集被所有5個TFs綁定。有趣的是，這個位點的子集是位于以H3K27A為標(biāo)記的開放染色質(zhì)中的位點（圖5B）。

圖5. HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1和AR與活性增強(qiáng)子共結(jié)合。

（A） 顯示的是HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1，和AR熱圖以HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1或AR結(jié)合位點的基因組位置為中心。每行代表該行旁邊顯示的TF結(jié)合位點的基因組位置。在每一列中，紅色框概述了給定因子的結(jié)合位點，該位點映射在同一因子的結(jié)合位置。

（B）顯示的是HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1，AR，ATAC-seq，H3K27Ac和H3K4me1數(shù)據(jù)（以列標(biāo)題表示）的標(biāo)簽密度圖和熱圖，這些數(shù)據(jù)以與HOXC6，HOXC4和HOXB13共同結(jié)合的位點的基因組位置為中心。