圖1.HMGN與染色質(zhì)互作和對(duì)Rex1表達(dá)影響的模型。染色質(zhì)環(huán)是由位于基因座上游和下游區(qū)域兩側(cè)的CTCF分子互作形成的，Rex1基因座位于染色質(zhì)環(huán)內(nèi)。在WT細(xì)胞（圖的左側(cè)）中，位于5位超級(jí)增強(qiáng)子上的NANOG，OCT4和SOX2與Rex1基因的結(jié)合促進(jìn)了與近端調(diào)控元件的相互作用，從而促進(jìn)了Rex1表達(dá)。HMGN的丟失（右側(cè)）不會(huì)影響CTCF結(jié)合，但會(huì)增加H1的占有率，解除轉(zhuǎn)錄因子與超級(jí)增強(qiáng)子的結(jié)合，并降低DNase I敏感性和標(biāo)記活性染色質(zhì)的組蛋白修飾水平。這些表觀遺傳學(xué)的變化可以防止Rex1增強(qiáng)子和Rex1近端調(diào)節(jié)位點(diǎn)之間的接觸，從而下調(diào)Rex1的表達(dá)。

    作者進(jìn)行LIF / 2i（可使懸浮生長(zhǎng)的小鼠ESC保持其多能性）去除后的第0、2、4、6天基因表達(dá)分析，顯示與WT相比HMGN DKO中176、239、447和592個(gè)基因的表達(dá)下降而只有13個(gè)基因始終被下調(diào)（圖2A）。表明，在每個(gè)分化階段，HMGNs調(diào)節(jié)一組獨(dú)特基因的表達(dá)。在DKO細(xì)胞中始終被下調(diào)的13個(gè)基因中，作者研究了Rex1（Zfp-42，一種已知會(huì)影響多能性的鋅指蛋白）。Q-pcr顯示Rex1在小鼠胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)，在LIF / 2i去除后的第2天，ESC中Rex1表達(dá)被顯著下調(diào)（圖2B），在HMGNs DKO ESC中，Rex1的表達(dá)比野生型ESC中的表達(dá)低3倍以上，并且在EB分化的所有6天中，DKO細(xì)胞中Rex1的轉(zhuǎn)錄仍然較低（圖2B和C）。相反，HMGNs的丟失對(duì)管家基因如Actb的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響（圖2D）。WB也證實(shí)DKO中的REX1蛋白水平比WT細(xì)胞低50％以上（圖2E）。說(shuō)明Rex1轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)歸因于HMGN的丟失。

圖2. HMGN蛋白影響Rex1表達(dá)。

（A）維恩圖顯示了在LIF / 2i去除后的不同天，與WT胚胎干細(xì)胞相比，DKO中下調(diào)基因之間的重疊。圖的外圍顯示了在每個(gè)EB分化階段DKO中表達(dá)下調(diào)的基因總數(shù)（1.3倍； P <0.05）。圖的右邊列出的13個(gè)基因在整個(gè)分化過(guò)程中均被下調(diào)。

（B）在LIF / 21退出后指定天數(shù)后通過(guò)mRNA-seq分析WT和DKO ESC中Rex1的轉(zhuǎn)錄水平。（C）3個(gè)生物學(xué)復(fù)制的IGV數(shù)據(jù)，顯示ESC中Rex1的mRNA水平。

（D）IGV顯示Actb的mRNA水平作為對(duì)照。

（E）WB檢測(cè)ESC中REX1的表達(dá)。

   為了了解HMGNs調(diào)節(jié)Rex1表達(dá)的機(jī)制，作者首先檢測(cè)了HMGNs的丟失是否改變?cè)摶虻恼{(diào)控區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)HMGN1和HMGN2的ChIP-seq分析顯示在Rex1基因的5個(gè)區(qū)域和兩個(gè)富含H3K27ac和H3K4me1的上游區(qū)域有較高的HMGN占用率。位于距Rex1基因14 kb處的遠(yuǎn)端（圖3中的棕星）顯示出較高的DNaseI相對(duì)敏感性，這對(duì)應(yīng)已知的ESC特異性增強(qiáng)子。HMGN的缺失導(dǎo)致DNaseI敏感性以及H3K27ac和H3K4me1水平顯著降低（圖2中的箭頭），會(huì)導(dǎo)致基因H3K27ac和H3K4me1（箭頭）以及H3K4me3，H3K9Ac和H2BK5ac在該基因的最接近5區(qū)的水平降低（圖3中的虛線框），而這些轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)標(biāo)記的下調(diào)不如在遠(yuǎn)端超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域看到的明顯?？傊覀儗?duì)WT和DKO ESC的ChIP-seq分析表明，HMGN蛋白的缺失降低了Rex1調(diào)控位點(diǎn)的活性染色質(zhì)標(biāo)記和DNase I超敏性水平。

圖3. HMGN的缺失改變了Rex1基因座的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。顯示的是IGV，描述了HMGN1和HMGN2的占有率，DNase I超敏性（DHS）以及從WT和DKO小鼠中分離出的ESC的Rex1基因座上所示的組蛋白修飾水平。 黃色列突出顯示了近端（紅星）和遠(yuǎn)端（棕星）增強(qiáng)子區(qū)域的位置。箭頭指向DKO細(xì)胞中DNase1，H2K27ac和H3K4me1的丟失，Rex1基因近端5區(qū)的表觀遺傳變化在虛線框內(nèi)可見。

已知ESC中Rex1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子OCT4，NANOG和SOX2調(diào)控。mRNA序列分析表明HMGN蛋白的丟失不會(huì)影響Oct4，Nanog或Sox2的轉(zhuǎn)錄水平（圖4A），因此HMGN可能是通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Rex1表達(dá)。ChIP-seq分析顯示，位于Rex1基因5處的超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域（圖4B，棕星）處的所有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均具有較高的占有率，而在近端增強(qiáng)子區(qū)域則沒(méi)有（圖4B紅星），HMGN的喪失完全消除了OCT4，NANOG的結(jié)合，并降低了SOX2與Rex1超級(jí)增強(qiáng)劑的結(jié)合（圖4A，箭頭）。H1促進(jìn)并穩(wěn)定染色質(zhì)的縮合，可能降低染色質(zhì)調(diào)節(jié)位點(diǎn)的活性。為了確定HMGNs是否影響組蛋白H1染色質(zhì)的占有率，用H1抗體ChIP-qPCR （圖4C）。在WT中，與Rex1超增強(qiáng)子重疊的所有三個(gè)區(qū)域中H1的占有率明顯低于與相鄰非調(diào)節(jié)區(qū)域重疊的五個(gè)區(qū)域中的每個(gè)區(qū)域中的占有率（比較圖4D中的藍(lán)色條）。HMGN的丟失會(huì)導(dǎo)致Rex1超級(jí)增強(qiáng)器中三個(gè)位置的每個(gè)位置的H1占用顯著上調(diào)（圖4D）。 WT細(xì)胞中非調(diào)節(jié)位點(diǎn)H1的平均占有率與DKO細(xì)胞中的相同，但在超增強(qiáng)位點(diǎn)，HMGN的丟失導(dǎo)致H1占有率增加了50％（圖4E）。這解釋了該調(diào)控位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子占有率降低和活性染色質(zhì)的表觀遺傳標(biāo)記的喪失。

圖4. HMGN-H1互作調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與Rex1超級(jí)增強(qiáng)子的結(jié)合。

（A）mRNA-seq，HMGN的丟失不影響Oct4，Nanog或Sox2的表達(dá)。

（B）IGV顯示DKO ESC中Rex1超級(jí)增強(qiáng)子的OCT4，NANOG和SOX2結(jié)合丟失。紅色和棕色的星星分別表示近端增強(qiáng)子和超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)域的位置。箭頭指向轉(zhuǎn)錄因子的位置，在底部顯示的這些調(diào)控區(qū)域中選擇組蛋白標(biāo)記。

（C）選擇用于組蛋白H1 ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)的基因組區(qū)域。

（D）q-pcr檢測(cè)C中所示Rex 1的五個(gè)非調(diào)節(jié)區(qū)域和三個(gè)超級(jí)增強(qiáng)器區(qū)域中WT和DKO ESC中的H1相對(duì)占有率。（E）DKO中Rex1超級(jí)增強(qiáng)子的H1占有率升高，但相鄰的非調(diào)節(jié)染色質(zhì)區(qū)域中不變。

   先前的ChIA PET結(jié)果揭示了Rex1遠(yuǎn)端超級(jí)增強(qiáng)子與Rex1啟動(dòng)子之間存在顯著互作（圖5A），從而增加了連接這些調(diào)控位點(diǎn)的染色質(zhì)環(huán)控制Rex1表達(dá)水平的可能性。為了測(cè)試這種可能性，作者進(jìn)行3C實(shí)驗(yàn)分析，并比較了WT和DKO ES細(xì)胞中Rex1啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的互作。3C文庫(kù)的PCR擴(kuò)增顯示，靶向5個(gè)上游Rex1調(diào)控區(qū)域產(chǎn)生了一條清晰的條帶，表明調(diào)控因子之間的互作頻率很高，相反，相同的引物組不能擴(kuò)增從DKO細(xì)胞生成的3C文庫(kù)（圖5C）。 Sanger測(cè)序證實(shí)，源自WT文庫(kù)的PCR產(chǎn)物由與Rex1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域相鄰的DNA序列組成（圖5D）?？傊珻hIA-PET和3C實(shí)驗(yàn)均表明，在WT細(xì)胞的染色質(zhì)中，位于該基因5個(gè)近端區(qū)域的Rex1調(diào)控位點(diǎn)與位于14kb轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游以上的遠(yuǎn)端超增強(qiáng)子互作，而在缺乏HMGN的DKO細(xì)胞中則沒(méi)有。

圖5. HMGN的缺失破壞了Rex1 5調(diào)控區(qū)的染色質(zhì)互作。

（A）Rex1基因座上染色質(zhì)調(diào)節(jié)區(qū)之間相互作用的ChIA-PET分析。頂部顯示管制區(qū)域和所選的組蛋白標(biāo)記。圖中的每條線表示兩個(gè)基因組基因座之間檢測(cè)到的相互作用。

（B）用于檢測(cè)Rex1的5個(gè)調(diào)控區(qū)中的染色質(zhì)互作的3C實(shí)驗(yàn)示意圖。

（C）使用位于Rex1的5個(gè)調(diào)節(jié)子區(qū)域的引物對(duì)3C文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。

（D）Sanger測(cè)序證實(shí)PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于位于Rex1的5個(gè)區(qū)域中調(diào)節(jié)位點(diǎn)附近的兩個(gè)區(qū)域的連接。