用胞嘧啶-5-亞甲基磺酸鹽（CMS-IP）抗體免疫沉淀基因組DNA，分析用脂多糖（LPS）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）激活的小鼠B細(xì)胞中5hmC沉積的動(dòng)力學(xué)，用于研究CSR的充分表征的體外系統(tǒng)（圖1A）。絕大多數(shù)5hmC標(biāo)記的區(qū)域（~160,000）在活化前和活化后的B細(xì)胞之間共享（圖1B）。72小時(shí)激活的B細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞中約9500個(gè)差異羥甲基化區(qū)域（DhmRs）中，大多數(shù)（8454）增加了5hmC（DhmR72h-up），而更少數(shù)量（928）減少了5hmC（DhmRdown） ）（圖1B和C）。DhmRs通常距離最近的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）超過(guò)10kb并且它們的5hmC水平在激活后隨時(shí)間逐漸變化[DhmR72h-up（圖1D）和DhmR72h-down（圖S1C）。由TET蛋白產(chǎn)生的5hmC是DNA去甲基化中已知的中間體。為了將5hmC與DNA甲基化的變化聯(lián)系起來(lái)，作者比較了在幼稚和72-后激活的B細(xì)胞中5hmC分布與已發(fā)表的全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS）數(shù)據(jù)，在相似條件下激活48小時(shí)的B細(xì)胞。雖然WGBS不能區(qū)分5mC和5hmC，但5hmC通常是5mC的小部分（1到10％），因此，在這里將WGBS信號(hào)稱為“DNA甲基化”。在24,48和72小時(shí)顯示增加的5hm的區(qū)域（DhmR24h-up，DhmR48h-up和DhmR72h-up）也顯示DNA甲基化減少（圖1E）?？偟膩?lái)說(shuō)，5hmC沉積的區(qū)域?qū)?yīng)于B細(xì)胞活化期間DNA低甲基化的區(qū)域。DhmR72h-up和DMR48h-down區(qū)域的基序富集分析顯示，兩者均富含核因子B（NF-B）（Rel同源結(jié)構(gòu)域）和bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子的共有結(jié)合序列即“復(fù)合”IRF：bZIP基序（圖1F）。為了辨別5hmC和增強(qiáng)子之間的關(guān)系，作者對(duì)幼稚和活化的B細(xì)胞增強(qiáng)子進(jìn)行了分層，由H3K4單甲基化（H3K4me1）定義，基于H3K27乙酰化水平（H3K27Ac），一種跟蹤增強(qiáng)子活性的修飾。相對(duì)于平衡的（H3K4me1+H3K27Ac-）增強(qiáng)子，5hmC在活性（H3K4me1+H3K27Ac+）中最高度富集（圖1G）。此外，由H3K27Ac定義的活化B細(xì)胞中超過(guò)75％的先前鑒定的超級(jí)增強(qiáng)劑與至少一個(gè)DhmR72h-up區(qū)域重疊（圖1H）：例如，Ccr4基因座處的3'遠(yuǎn)端元件顯示5hmC和H3K27Ac的激活依賴性增加，伴隨著特定CpGs甲基化的喪失和mRNA表達(dá)的增加（圖1I和J）。以上的數(shù)據(jù)顯示5hmC修飾和DNA去甲基化與B細(xì)胞活化期間的增強(qiáng)子活性相關(guān)。

圖1. B細(xì)胞活化期間5hmC的動(dòng)態(tài)變化。

A．實(shí)驗(yàn)流程圖。

B．未刺激和活化的B細(xì)胞中5hmC富集區(qū)域之間的比較（72小時(shí)）。

C．DhmR的數(shù)量。

D．DhmR72h-up（左）中5hmC修飾的動(dòng)力學(xué)。相同數(shù)量的隨機(jī)選擇的共同5hmC標(biāo)記區(qū)域（中間）和隨機(jī)區(qū)域（右）沒(méi)有增加。5hmC富集顯示為每100bp bin的標(biāo)準(zhǔn)化讀數(shù)。

E．相對(duì)于幼稚B細(xì)胞，在24h和48h激活的B細(xì)胞中增加5hmC的85和1953區(qū)域在48小時(shí)后在其中心顯示減少的“甲基化”,計(jì)算6kb的每個(gè)200bp箱的平均甲基化。

F．DhmR72h-up的基序富集分析。常用的5hmC富集區(qū)域用作分析背景。該y軸表示相對(duì)于背景的倍數(shù)富集，圓形大小表示含有相應(yīng)基序的區(qū)域的百分比，顏色表示顯著性（log10 P值）。

G.相對(duì)于活化和幼稚B細(xì)胞中的平衡（H3K4me1 + H3K27Ac lo）增強(qiáng)子，5hmC富含活性（H3K4me1 + H3K27Ac hi）。

H.通過(guò)高H3K27Ac富集鑒定的大部分超級(jí)增強(qiáng)子（352個(gè)，459個(gè)，76.7％）與DhmR72h-up重疊。

I.Ccr4基因座（mm10; chr9：114,484,000至114,501,000）作為活化后具有增加的5hmC，增加的H3K27Ac和減少的CpG甲基化的區(qū)域的實(shí)例。

J.活化的B細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)Ccr4 mRNA表達(dá)（通過(guò)RNA-seq）。

 （1）野生型和Tet2/3雙缺陷B細(xì)胞的比較鑒定了TET響應(yīng)性調(diào)節(jié)元件

TET2和TET3是B細(xì)胞中表達(dá)的兩種主要TET蛋白（圖2A）。為了評(píng)估TET蛋白在調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能中的作用，用他莫昔芬處理Cre^ERT2Tet2^fl/flTet3 ^fl/fl Rosa26-YFPLSL 5天以敲除Tet2和Tet3（雙敲除，DKO）。Tet2^fl/fl Tet3 ^fl/fl Rosa26-YFPLSL野生型（WT）小鼠用作對(duì)照; YFP報(bào)告Cre表達(dá)。分離B細(xì)胞并用LPS和IL-4活化（圖2B），Tet2細(xì)胞和Tet3均在B細(xì)胞中有效缺失（圖2C），YFP+細(xì)胞顯示出相似的成熟脾濾泡B細(xì)胞頻率（圖2A和B）。在激活72h時(shí)，大約2300個(gè)5hmC富集區(qū)域在WT和DKO之間顯著不同，與Tet2 / 3DKO B細(xì)胞相比，在對(duì)照中顯著更多區(qū)域獲得5hmC（圖2，D和E），大多數(shù)距離最近的TSS> 10 kb（圖S2D）。在與Tet2/3 DKO B細(xì)胞（“WT> DKO DhmR”）相比，WT中具有更高5hmC的2139“TET調(diào)節(jié)的”DhmR中，2020（94.4％）與DhmR72-up區(qū)域顯著重疊，大多數(shù)顯示在富含RHD，bZIP和復(fù)合IRF：bZIP基序（圖2F）。

圖2.WT和Tet2 / 3DKO B細(xì)胞中5hmC修飾的比較。

A.TET家族成員（來(lái)自RNA-seq）的平均mRNA表達(dá)。

B.小鼠的描述和實(shí)驗(yàn)流程圖。

C.有效刪除Tet2和Tet3。通過(guò)qRT-PCR分析來(lái)自他莫昔芬處理的WT對(duì)照和Tet2/3 DKO小鼠的B細(xì)胞中的Tet2和Tet3表達(dá)。

D.WT和Tet2 / 3DKO B細(xì)胞之間富含差異5hmC的區(qū)域（DhmR）的數(shù)目。

E.在WT和DKO之間在DhmRs72h從WT（左）和Tet2/3DKO（右）富集5hmC的動(dòng)力學(xué)。 DKO中5hm降低的區(qū)域如上所示（WT> DKO），5hmC升高的區(qū)域如下所示（DKO> WT）。

F.DhmR72h-WT> DKO的基序富集分析（如圖1F中分析）。

（2）TET2和TET3調(diào)控Ig CSR

為了評(píng)估Tet2/3缺失對(duì)體內(nèi)抗體反應(yīng)的影響，我們用4-羥基-3-硝基苯乙?；悸?lián)卵清蛋白免疫前用Tamoxifen處理Tet2 fl/fl Tet3 fl/fl Rosa26-LSL-YFP CreERT2和對(duì)照小鼠。 （NP-OVA）（圖3A）。WT和DKO的GC B細(xì)胞（CD19 + GL7 + Fas +）的總百分比相似（圖3，B和C），但NP特異性B細(xì)胞的頻率顯著增加（圖3D）。因?yàn)槭褂肅reERT2系統(tǒng)的急性Tet2/3缺失影響多種細(xì)胞類型，所以沒(méi)有在Tet2f1/f1Tet3f1/f1 CreERT2Rosa26YFPLSL小鼠中進(jìn)一步研究體內(nèi)B細(xì)胞表型。然而，這些小鼠中最值得注意的表型是從IgM到IgG1的CSR持續(xù)減少（圖3，E和F），證明了TET蛋白在體內(nèi)調(diào)節(jié)抗體反應(yīng)中的作用，特別是CSR。要確定是否CSR表型是B細(xì)胞內(nèi)在的，來(lái)自他莫昔芬處理的小鼠的B細(xì)胞用增殖追蹤染料（CellTrace Violet）標(biāo)記，并用LPS和IL-4活化4天（圖3G）。與體內(nèi)CSR缺陷一致，體外Tet2/3 DKO B細(xì)胞中的IgG1轉(zhuǎn)換始終低于WT B細(xì)胞（圖3，H和I）。與CSR減少相關(guān)，Tet2/3 DKO B細(xì)胞中環(huán)狀γ1 RNA的表達(dá)降低（圖3J）。此外，相對(duì)于WT B細(xì)胞，Tet2/3 DKO中的CSR至IgA也降低（圖3K-N）。Tet2CD的酶失活突變體（Tet2CDHxD）也部分恢復(fù)CSR，表明TET酶活性和支架功能在CSR中起作用（圖3G-I）。這些結(jié)果表明Tet2和Tet3是體外和體內(nèi)最佳CSR所必需的。

圖3. TET蛋白促進(jìn)CSR。

A.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的流程圖。

B.上圖：在如（A）中的NP-OVA免疫后，來(lái)自WT和Tet2 / 3DKO小鼠的引流性pop淋巴結(jié)處的CD19 + GL7 + Fas + GC B細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。下圖：與WT小鼠（GC B-門控）相比，Tet2 / 3DKO（YFP + GC B-門控）中GC B細(xì)胞中的IgG1轉(zhuǎn)換細(xì)胞減少。

C-F.（B）中所示的實(shí)驗(yàn)的定量。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的匯總結(jié)果。

G.體外IgG1轉(zhuǎn)換的流程圖。用細(xì)胞痕量紫標(biāo)記細(xì)胞，并用LPS和IL-4活化4天。

H和I.Tet2/3 DKO和WT小鼠中IgG1轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)圖（H）和定量（I）。

J.通過(guò)qRT-PCR定量環(huán)狀γ1 RNA水平。

K.體外IgA轉(zhuǎn)換的流程圖。用抗-CD40，rmIL-4，rmIL-5和rhTGF +將細(xì)胞活化5天。

L-N.IgG1轉(zhuǎn)換（M）和IgA轉(zhuǎn)換細(xì)胞（N）的流式細(xì)胞術(shù)圖（L）和定量（M和N）。

（1）TET2和TET3調(diào)節(jié)胞苷脫氨酶AID的表達(dá)

CSR是一種高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，涉及多種途徑。RNA測(cè)序（RNA-seq）分析鑒定了WT和Tet2/3 DKO B細(xì)胞之間差異表達(dá)的相對(duì)少量的基因，其中包括編碼AID的Aicda，這是一種對(duì)CSR至關(guān)重要的蛋白質(zhì)。qRT-PCR和Western印跡分析證實(shí)激活后Tet2/3 DKO中Aicda mRNA相對(duì)于WT B細(xì)胞減少> 50％（圖4A和B）。為了確定AID表達(dá)的減少是否是CSR缺陷的完全原因，作者表達(dá)了WT和催化失活的AID（AIDH56R / E58Q），WT和Tet2/3 DKO B細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，催化活性AID（AIDWT）的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)，但不是無(wú)活性的AIDH56R / E58Q，在很大程度上挽救了Tet2 / 3DKO B細(xì)胞中的CSR缺陷（圖4C和D，下圖）。與先前的觀察結(jié)果類似，WT細(xì)胞中AID的表達(dá)也增加了IgG1+細(xì)胞的頻率（圖4，C和D，左上圖和中圖）。由于Tet2/3不是表達(dá)CSR和ger1種系轉(zhuǎn)錄本所必需的，Tet2/3 DKO B細(xì)胞中大部分CSR缺陷可歸因于Aicda Mrna和AID蛋白表達(dá)的降低，導(dǎo)致測(cè)試TET蛋白通過(guò)Aicda基因的遠(yuǎn)端調(diào)控元件控制Aicda表達(dá)。

圖4.TET2/3通過(guò)調(diào)節(jié)胞苷脫氨酶AID的表達(dá)促進(jìn)CSR。

A.用LPS和IL-4活化4天的WT和Tet2/3 DKO B細(xì)胞中Aicda mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析。

B.來(lái)自第4天的全細(xì)胞裂解物的免疫印跡活化的WT和Tet2 / 3DKO與指定的抗體。

C和D.用空載體（Thy1.1，左），WT AID（AIDWT，中間）或催化失活的AID（AIDH56R / E58Q，右）轉(zhuǎn)導(dǎo)WT和Tet2 / 3 DKO B細(xì)胞。

（2）全基因組分析識(shí)別Aicda基因座中的TET響應(yīng)調(diào)節(jié)元件

多個(gè)保守調(diào)節(jié)元件影響Aicda表達(dá)（圖S5A）,其中Mfap5基因中-26kb的Aicda 5'增強(qiáng)子，基因間5'增強(qiáng)子和內(nèi)含子1增強(qiáng)子顯著增加H3K27Ac并在激活時(shí)損失5mC，并且統(tǒng)稱為Aicda“超級(jí)增強(qiáng)子”（圖5A）。TET2的ChIP-seq顯示這些調(diào)節(jié)元件中的每一個(gè)都被激活的B細(xì)胞中的TET2占據(jù)（圖5A）。這些-26kb Mfap5內(nèi)含子區(qū)和-8kb 5'基因間區(qū)域（此處分別稱為TetE2和TetE1）受TET調(diào)節(jié)，B細(xì)胞活化誘導(dǎo)5hmC的TET依賴性增加（圖5B），將它們放在WT> DKO DhmRs的類別中（圖2D和E）。TetE1似乎是TET2/3的主要靶標(biāo)，因?yàn)樗诩せ詈缶哂懈蟮?hmC增益（圖5B）。相比之下，Aicda啟動(dòng)子等區(qū)域甚至在激活前標(biāo)記為5hmC，表明這些區(qū)域的5hmC可能在B細(xì)胞分化的前一階段產(chǎn)生，然后維持到幼稚外周B細(xì)胞的出現(xiàn)。B細(xì)胞活化在TetE1誘導(dǎo)強(qiáng)H3K27Ac和DNA去甲基化（圖5A）。 因?yàn)閬喠蛩釟潲}測(cè)序不能區(qū)分5mC和5hmC，作者使用氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序（oxBS-seq）來(lái)評(píng)估WT和Tet2/3 DKO細(xì)胞中TetE1的5mC，5hmC和未修飾的C水平，TetE1和Aicda啟動(dòng)子中的CpG在活化前顯示出相似的5mC和5hmC水平（圖5C,比較0小時(shí)圖）。 在活化后72小時(shí)，WT B細(xì)胞中5mC顯著降低，相反TetE1和Aicda啟動(dòng)子都在Tet2/3 DKO B細(xì)胞中甲基化（圖5C，下圖;比較72小時(shí)圖）。這些結(jié)果表明TET2和TET3通過(guò)結(jié)合并在TetE1和TetE2處沉積5hmC來(lái)調(diào)節(jié)Aicda表達(dá)。

圖5.TET2和TET3通過(guò)TET反應(yīng)元件TetE1和TetE2控制Aicda表達(dá)。該圖顯示了位于Aicda基因5'的兩個(gè)保守的TET反應(yīng)元件TetE1和TetE2（用綠色矩形和灰色陰影標(biāo)記）。A.前兩個(gè)軌跡：ChIP-seq分析，與Ig對(duì)照（灰色）相比，激活后TET2（藍(lán)色）特異性結(jié)合Aicda基因座中的多個(gè)元件。中間（綠色）：激活后增加H3K27Ac。底部：激活誘導(dǎo)TetE1和TetE2處的DNA去甲基化。WGBS顯示幼稚和48小時(shí)激活的B細(xì)胞（mCG;黑色）中的DNA甲基化（5mC + 5hmC）。

B.在Aicda遠(yuǎn)端元件處的活化誘導(dǎo)的TET2/3依賴性5hmC沉積。顯示了72小時(shí)活化后WT和DKO之間差異的5hmC富集區(qū)域（WT> DKO DhmR72h）。

C.TET2/3沉積5hmC和去甲基化TetE1。上圖：在激活之前（0小時(shí)）和之后（72小時(shí)），使用從WT和Tet2 / 3DKO B細(xì)胞分離的DNA，通過(guò)oxBS-seq分析TetE1處的CpG修飾（5hmC，5mC和C）。底部：定量在TetE1中對(duì)所有CpG進(jìn)行5mC修飾的概率。

（3）TET2和TET3維持兩個(gè)Aicda TET反應(yīng)元件TetE1和TetE2的染色質(zhì)可及性

活性調(diào)節(jié)區(qū)通常存在于染色質(zhì)的可及區(qū)域并以標(biāo)記。為了評(píng)估染色質(zhì)可及性的動(dòng)態(tài)，作者在用LPS和IL-4刺激的B細(xì)胞中進(jìn)行ATAC-seq。WT> DKO DAR富含bZIP和BATF：IRF基序，類似于DhmR72h-up（圖1F）和WT> DKO DhmRs（圖2F）中的那些。著眼于Aicda基因座，我們發(fā)現(xiàn)激活與Aicda增強(qiáng)子TetE1和TetE2的可及性增加有關(guān)。 5hmC修飾在這兩種元素下連續(xù)增加直至72小時(shí)，在TetE1處具有更高水平的沉積（參見(jiàn)圖5B）。相比之下，染色質(zhì)可及性增加的時(shí)間過(guò)程在兩種增強(qiáng)劑上差異很大：TetE2在激活后24小時(shí)顯示可及性快速增加，而TetE1可及性增加的時(shí)間過(guò)程較慢，匹配5hmC沉積（比較圖5B和圖S6D）。這些數(shù)據(jù)表明bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子，TET催化活性和染色質(zhì)可及性之間的一致聯(lián)系。

    在開(kāi)發(fā)細(xì)胞譜系規(guī)范或激活過(guò)程中建立增強(qiáng)子之前，某些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與核小體相關(guān)區(qū)域結(jié)合并募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物和組蛋白修飾酶以產(chǎn)生活性增強(qiáng)子。為了識(shí)別Aicda基因座的潛在先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子，利用了先前的基序富集分析（圖1F和2F以及圖S1G）觀察到bZIP轉(zhuǎn)錄因子共有結(jié)合基序的強(qiáng)烈富集，在逐漸增加5hmC作為激活函數(shù)的區(qū)域（圖1F，DhmRup），與Tet2/3DKO B細(xì)胞相比，WT中5hmC高的區(qū)域（圖2F，WT> DKO DhmRs）和WT對(duì)Tet2/3 DKO B細(xì)胞具有更高可及性的區(qū)域。在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作者關(guān)注在活化B細(xì)胞中表達(dá)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，與之前的觀察結(jié)果一致，Batf mRNA和蛋白在激活后被誘導(dǎo)（圖6A和圖S8B），并且它們的表達(dá)先于Aicda的表達(dá)。兩個(gè)可區(qū)分的BATF ChIP seq峰中的一組（圖6B中的簇2）被TET調(diào)節(jié)，因?yàn)樵摯刂械姆屣@示在激活后5hmC中依賴于TET2/3依賴性的增加（圖6B和C）相反，簇1中的BATF峰顯示在5hmC中沒(méi)有顯著的活化依賴性增加（圖6B，上圖）。總體而言，激活誘導(dǎo)的5hmC（DhmR72-up）與BATF峰重疊的區(qū)域重疊，表明除了BATF之外，其他轉(zhuǎn)錄因子也有助于在Aicda促進(jìn)TET介導(dǎo)的5hmC生成。

圖6. BATF在TetE1促進(jìn)TET蛋白介導(dǎo)的羥甲基化。

A.Batf家族（Batf1至Batf3）的平均mRNA表達(dá)（RNA-seq）。

B和C.BATF結(jié)合與5hmC富集相關(guān)?；?hmC分布的模式將WT BATF峰分成兩個(gè)簇。B簇1顯示寬的5hmC分布，其中5hmC水平在活化后和不存在TET2/3時(shí)保持不變。相反，簇2中的大部分區(qū)域在活化后顯示出進(jìn)行性TET依賴性5hmC修飾（底部）。

D.向Aicda增強(qiáng)劑招募BATF和其他轉(zhuǎn)錄因子。

E.在TetE1進(jìn)行5hmC修改需要BATF。用LPS和IL-4活化Batf-WT和Batf-KO B細(xì)胞4天，使用AbaSI-qPCR定量TetE1處的5hmC修飾

BATF強(qiáng)烈地結(jié)合Aicda基因座中的TetE1和TetE2增強(qiáng)子，并且在較小程度上結(jié)合位于TetE1和TetE2之間的-21kb基因間增強(qiáng)子（圖6D，72小時(shí)WT和DKO;第二和第三軌跡） 。與未刺激細(xì)胞中缺乏BATF表達(dá)一致，在0小時(shí)時(shí)Aicda增強(qiáng)子的BATF占有率沒(méi)有增加（圖6D，0小時(shí)WT;頂部軌跡）。該結(jié)合模式類似于TET2（圖5A），以及E2A和PU.1（圖6D）。為了確定BATF是否作用于TET的上游，分析了WT和Batf缺陷B細(xì)胞中TET反應(yīng)元件TetE1的5hmC沉積。發(fā)現(xiàn)，BATF的缺失在TetE1處消除了活化誘導(dǎo)的羥甲基化（圖6E）。我們的結(jié)果與以下假設(shè)一致：BATF促進(jìn)TET2和/或TET3向TetE1和TetE2的募集，并通過(guò)在這些上游Aicda增強(qiáng)子處促進(jìn)5hmC修飾和DNA去甲基化來(lái)增加Aicda表達(dá)。如上所述，BATF對(duì)于Aicda調(diào)節(jié)是必需的。但是不能排除其他轉(zhuǎn)錄因子（包括其他bZIP家族成員）參與此過(guò)程。