圖1 FOXA1誘導(dǎo)TET1表達(dá)并與之互作調(diào)控增強(qiáng)子的表觀修飾

    為了確定FOXA1和活性增強(qiáng)子標(biāo)記之間的相關(guān)性，作者重新分析了先前發(fā)表的對(duì)照組和FOXA1敲低組的FOXA1，H3K4me2和H3K27ac ChIP-seq數(shù)據(jù)，以及進(jìn)行了MeDIP和hMe-Seal的高通量測(cè)序分析確認(rèn)FOXA1結(jié)合位點(diǎn)（FXBS）確實(shí)富含 H3K4me2和H3K27ac（圖2A）, 并且雖然所有FOXA1占據(jù)位點(diǎn)周?chē)?mC的平均強(qiáng)度在FOXA1敲低時(shí)沒(méi)有受到很大影響（圖2B），但5hmC顯著下降（圖2C），

而以FOXA1峰下游20kb的基因組區(qū)域（在本文中稱(chēng)為非峰位點(diǎn)）作為陰性對(duì)照的量度，沒(méi)有表現(xiàn)出任何明顯的模式（圖2A：底部，圖2D和E）?？紤]到5hmC豐度僅占胚胎干細(xì)胞中5mC的大約10％，在5hmC比5mC中觀察到更顯著的變化是合理的。隨后的MeDIP和hMe-Seal對(duì)各個(gè)FXBS基因進(jìn)行qPCR，在許多FXBS中，F(xiàn)OXA1敲低后5hmC大大降低（圖2F）。從這些結(jié)果可以推斷，F(xiàn)OXA1可以在其占據(jù)的區(qū)域特異性地改變DNA甲基化以實(shí)現(xiàn)去甲基化狀態(tài)，同時(shí)積累5hmC標(biāo)記，從而增加增強(qiáng)子活化。

圖2 FOXA1通過(guò)表觀遺傳修飾促進(jìn)增強(qiáng)子活化。

A ChIP-seq、MeDIP和hMe-Seal高通量測(cè)序分析的熱圖呈現(xiàn)FXBS位點(diǎn)H3K4me2、H3K27ac、5hmC和5mC的富集；

B和C 顯示的所有FXBS周?chē)ˋ上）5mC（B）和5hmC（C）富集的平均強(qiáng)度圖；

D和E 顯示的所有非峰位點(diǎn)周?chē)ˋ下）5mC（D）和5hmC（E）富集的平均強(qiáng)度圖；

F 在對(duì)照和shFOXA1 LNCaP細(xì)胞對(duì)hMe-Seal進(jìn)行的代表性FXBS基因Qpcr檢測(cè)5hmC特異性變化。

（1）FOXA1正調(diào)控TET1的表達(dá)

   由于TET蛋白催化的DNA去甲基化，作者接下來(lái)檢測(cè)TET基因表達(dá)是否與FOXA1相關(guān)。首先在一組12個(gè)前列腺細(xì)胞系中對(duì)FOXA1和TET1轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明TET1與FOXA1的表達(dá)趨勢(shì)相似（圖3A,B）。那么FOXA1是否調(diào)節(jié)TET1基因表達(dá)？為了測(cè)試這一點(diǎn)，首先檢測(cè)了對(duì)照或FOXA1敲低的LNCaP細(xì)胞中的TET1水平，在FOXA1敲低后LNCaP細(xì)胞中TET1轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平均顯著降低（圖3C，D），同時(shí)，另一種獨(dú)立的前列腺癌細(xì)胞系C4-2B中FOXA1的消耗也導(dǎo)致TET1表達(dá)的降低（圖3E）。另一方面，當(dāng)FOXA1在22Rv1和DU145細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，TET1表達(dá)增強(qiáng)（圖3F,G）。為了在細(xì)胞水平上可視化FOXA1對(duì)TET1的誘導(dǎo)作用，進(jìn)行了免疫熒光染色。在用空載體對(duì)照的DU145細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到TET1，在用腺病毒FOXA1感染（Flag標(biāo)記，顯示為紅色）時(shí)，TET1染色（以綠色顯示）顯著增強(qiáng)（圖3H）。這些數(shù)據(jù)支持FOXA1正調(diào)節(jié)TET1基因的表達(dá)。

圖3 FOXA1誘導(dǎo)TET1表達(dá)

A和B q-pcr檢測(cè)12個(gè)前列腺細(xì)胞系的FOXA1和TET1基因的表達(dá)

C和D 分別q-pcr和WB檢測(cè)LNCaP細(xì)胞系中FOXA1敲低對(duì)TET1表達(dá)的影響

E 分別q-pcr和WB檢測(cè)C4-2B細(xì)胞系中FOXA1敲低對(duì)TET1表達(dá)的影響

F和G WB檢測(cè)22Rv1和DU145細(xì)胞系中FOXA1過(guò)表達(dá)對(duì)TET1表達(dá)的影響

H 免疫熒光檢測(cè)FOXA1表達(dá)對(duì)TET1表達(dá)的影響

（2）TET1基因是FOXA1的直接靶標(biāo)

為了確定FOXA1如何轉(zhuǎn)錄控制TET1表達(dá)，作者分析了先前從LNCaP細(xì)胞獲得的FOXA1 ChIP-seq數(shù)據(jù)，并在TET1基因的外顯子區(qū)域內(nèi)，即外顯子3和4之間觀察到強(qiáng)烈的FOXA1結(jié)合（圖4A）。與FOXA1通過(guò)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子環(huán)化調(diào)節(jié)靶基因的增強(qiáng)子一致，作者還在TET1啟動(dòng)子處發(fā)現(xiàn)了弱的FOXA1結(jié)合。為了驗(yàn)證ChIP-seq的結(jié)果，進(jìn)行了ChIP-qPCR，發(fā)現(xiàn)FOXA1在TET1增強(qiáng)子中相對(duì)于IgG對(duì)照富集了近170倍，并且在TET1啟動(dòng)子處約10倍（圖4B），富集水平與前列腺特異性抗原基因增強(qiáng)子（PSA）相當(dāng)。此外，在敲低后，富集水平大大減少（圖4C）。接下來(lái)，為了檢查T(mén)ET1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子處的FOXA1占據(jù)是否導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，作者將這些區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體中。熒光素酶測(cè)定顯示FOXA1過(guò)表達(dá)確實(shí)顯著增加而FOXA1敲低減少TET1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子活性（圖4D和E）。為了進(jìn)一步證明該調(diào)節(jié)是由于TET1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的FOXA1占據(jù)，對(duì)TET1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子內(nèi)FKHD基序的FOXA1結(jié)合峰周?chē)腄NA進(jìn)行突變測(cè)定，熒光素酶測(cè)定顯示FKHD基序的突變消除了TET1增強(qiáng)子的FOXA1調(diào)節(jié)以及啟動(dòng)子活性（圖4F）。這些數(shù)據(jù)支持FOXA1直接結(jié)合TET1的調(diào)控元件以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。

圖4 FOXA1結(jié)合到增強(qiáng)子和啟動(dòng)子誘導(dǎo)TET1表達(dá)

A CHIP-seq數(shù)據(jù)分析表明FOXA1在TET1基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域富集；

B和C CHIP-QPCR驗(yàn)證FOXA1在TET1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的富集；

D和E 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXA1對(duì)TET1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性的影響；

F 對(duì)TET1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域FOXA1結(jié)合位點(diǎn)突變后的熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

（1）FOXA1的FH結(jié)構(gòu)域與TET1的CXXC結(jié)構(gòu)域互作

由于FOXA1有助于局部DNA去甲基化（圖2），TET1是已知的DNA去甲基化酶，作者假設(shè)TET1的作用可能歸因于FXBS周?chē)腄NA去甲基化。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者研究了FOXA1和TET1蛋白之間的潛在相互作用。首先用Flag標(biāo)記的TET1和FOXA1或空載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞使用抗FOXA1抗體進(jìn)行CO-IP，確認(rèn)FOXA1能將TET1蛋白拉下（圖5A），然后將TET1克隆到SFB標(biāo)記的表達(dá)載體中，這使得能夠使用S-蛋白瓊脂糖珠下拉TET1蛋白并通過(guò)抗Flag抗體檢測(cè)，CO-IP結(jié)果表明TET1蛋白能拉下FOXA1（圖5B）。圖5C則是直接的用蛋白本身的抗體相互IP證明兩者具有細(xì)胞內(nèi)源性互作。為了進(jìn)一步確定與FOXA1的互作的TET1蛋白結(jié)構(gòu)域，作者構(gòu)建了四個(gè)Myc標(biāo)記的TET1結(jié)構(gòu)域構(gòu)載體，即N末端，CXXC，中間和CD結(jié)構(gòu)域，與用SFB標(biāo)記的FOXA1共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。S-pull down下拉的WB顯示僅含有CXXC模塊的TET1片段能夠結(jié)合FOXA1（圖5D）。另一方面，為了找出與TET1蛋白互作的FOXA1結(jié)構(gòu)域。類(lèi)似地，構(gòu)建了三個(gè)Flag標(biāo)記的FOXA1結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體，即N-末端，F(xiàn)orkhead（FH）和C-末端結(jié)構(gòu)域，其與SFB標(biāo)記的TET1-CXXC結(jié)構(gòu)域共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中然后進(jìn)行S-pull down的WB檢測(cè)，結(jié)果顯示FOXA1的FH結(jié)構(gòu)域與TET1的CXXC結(jié)構(gòu)域互作（圖5E）。

圖5 FOXA1與TET互作

A-C CO-IP驗(yàn)證FOXA1與TET1的互作關(guān)系

D CO-IP檢測(cè)與FOXA1結(jié)合的TET1結(jié)構(gòu)域?yàn)镃XXC

E CO-IP檢測(cè)與TET1結(jié)構(gòu)域CXXC結(jié)合的FOXA1結(jié)構(gòu)域?yàn)镕H

（2）TET1介導(dǎo)FOXA1依賴(lài)性增強(qiáng)子的表觀遺傳激活

為了確定TET1是否影響FOXA1占據(jù)的增強(qiáng)子的表觀遺傳修飾，首先測(cè)試TET1是否能夠共同占據(jù)FOXA1結(jié)合的基因組區(qū)域。通過(guò)ChIP-qPCR表明在表達(dá)HA-TET1的細(xì)胞中比在用HA-對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中FXBS富集更強(qiáng)的HA（TET1）富集（圖6A）。接下來(lái)，為了檢測(cè)TET1如何改變這些FOXA1結(jié)合區(qū)域周?chē)腄NA甲基化，shRNA進(jìn)行了TET1敲低（圖6B）。然后通過(guò)hMe-Seal-seq檢測(cè)5hmCTET1敲低后總5hmC富集區(qū)域顯著減少（圖6C）和MeDIP-seq檢測(cè)5mC顯示增加了近33％（圖6D）。所有峰的平均強(qiáng)度視圖顯示hMe-Seal信號(hào)顯著降低，而MeDIP信號(hào)在TET1敲低后增加（圖6E）。圍繞FXBS的基因增強(qiáng)子表觀遺傳修飾的分析在TET1耗盡后總體減少5hmC和增加5mC，表明TET1對(duì)于維持這些增強(qiáng)子的去甲基化狀態(tài)是關(guān)鍵的（圖6F和G）。由于已顯示DNA甲基化抑制增強(qiáng)子激活，接下來(lái)檢測(cè)TET1敲低是否阻止FXBS的增強(qiáng)子激活。ChIP-qPCR顯示在TET1耗盡后H3K4me2和H3K27ac確實(shí)均顯著降低（圖6H和1）。進(jìn)一步ChIP-seq證實(shí)了TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降（圖6J）。這些數(shù)據(jù)支持TET1表達(dá)通過(guò)介導(dǎo)活性DNA去甲基化促進(jìn)FOXA1-靶標(biāo)增強(qiáng)子的活化。

圖6 TET1表達(dá)通過(guò)介導(dǎo)活性DNA去甲基化促進(jìn)FOXA1-靶標(biāo)增強(qiáng)子的活化

A HA-TET1 CHIP-QPCR檢測(cè)表明TET1在FXBS位點(diǎn)富集

B WB檢測(cè)TET1敲低效果

C hMe-Seal和MeDIP-seq數(shù)據(jù)分析表明TET1敲低后5hmC顯著降低5mC增加

E hMe-Seal平均強(qiáng)度視圖

F-G hMe-Seal和MeDIP-seq數(shù)據(jù)分析聚焦于FXBS位點(diǎn)

H-I CHIP-QPCR檢測(cè)FXBS位點(diǎn)的H3K4me2和H3K27ac的富集表明TET1敲低后FXBS位點(diǎn)富集降低

J ChIP-seq證實(shí)TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降

報(bào)道DNA甲基化和H3K4me2去除可能損害FOXA1結(jié)合，在TET1耗盡后觀察到的DNA甲基化和組蛋白修飾的變化提示FOXA1向這些區(qū)域的富集被破壞。為了測(cè)試這一點(diǎn)，作者在對(duì)照和TET1敲低LNCaP細(xì)胞中進(jìn)行FOXA1 ChIP-seq以確定TET1消耗是否能夠調(diào)節(jié)FOXA1染色質(zhì)靶標(biāo)。結(jié)果顯示在TET1敲低時(shí)，F(xiàn)OXA1結(jié)合能力顯著降低（圖7A）。此外，即使對(duì)于TET1敲低后未完全消除的位點(diǎn)（即共享位點(diǎn)），F(xiàn)OXA1結(jié)合的平均強(qiáng)度似乎也弱得多（圖7B）。幾種依賴(lài)于FOXA1的增強(qiáng)子的基因組視圖進(jìn)一步說(shuō)明了TET1耗盡細(xì)胞中FOXA1占據(jù)的顯著喪失（圖7C和D）。同時(shí)，這些增強(qiáng)子的DNA甲基化增加，即5mC增加但5hmC信號(hào)減少，而活性增強(qiáng)子標(biāo)記H3K4me2減少，與全基因組切換到抑制性染色質(zhì)狀態(tài)一致。此外，ChIP-qPCR證實(shí)TET1敲低顯著降低多個(gè)靶標(biāo)增強(qiáng)子的FOXA1占有率（圖7E）。由于TET1通過(guò)其CXXC結(jié)構(gòu)域與FOXA1蛋白相互作用但通過(guò)其CD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行酶活性，我們接下來(lái)試圖從機(jī)理上理解CD介導(dǎo)的DNA去甲基化是否足夠促進(jìn)FOXA1招募到靶標(biāo)增強(qiáng)子。為了測(cè)試這一點(diǎn)，作者用TET1敲低在LNCaP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD結(jié)構(gòu)域。 ChIP-qPCR確認(rèn)TET1敲低使靶向增強(qiáng)子的FOXA1結(jié)合降低，重要的是，可以通過(guò)伴隨的CD結(jié)構(gòu)域過(guò)表達(dá)完全挽救（圖7F）。這些數(shù)據(jù)支持TET1通過(guò)活性去甲基化促進(jìn)FOXA1募集到靶標(biāo)增強(qiáng)子

圖7 TET1通過(guò)活性去甲基化促進(jìn)FOXA1募集到靶標(biāo)增強(qiáng)子

A-B CHIP-SEQ統(tǒng)計(jì)FOXA1富集量表明TET1敲低后FXBS位點(diǎn)顯著降低

C-D SEQ視圖顯示TET1耗盡FOXA1占據(jù)靶標(biāo)降低，活性增強(qiáng)子標(biāo)記H3K4me2減少，5mC增加但5hmC信號(hào)減少

E ChIP-qPCR證實(shí)TET1敲低顯著降低多個(gè)靶標(biāo)增強(qiáng)子的FOXA1占有率

F ChIP-qPCR確認(rèn)TET1敲低使靶向增強(qiáng)子的FOXA1結(jié)合降低，重要的是，可以通過(guò)伴隨的CD結(jié)構(gòu)域過(guò)表達(dá)完全挽救