Dicer promotes tumorigenesis by translocating to nucleus to promote SFRP1 promoter methylation in cholangiocarcinoma cells

日期：2017-08-23 標簽：甲基化

DNA甲基化研究案例（三）

一、調(diào)控通路

膽管癌細胞的Dicer高度表達后進入細胞核，與HP1α蛋白復合體結(jié)合互作，促進SFRP1啟動子的組蛋白和CpG島DNA甲基化，從而抑制SFRP1的表達。

二、實驗流程

作者首先通過免疫組化檢測膽管癌細胞和癌旁組織細胞的Dicer的表達情況表明膽管癌細胞的Dicer高表達，然后對細胞進行核質(zhì)分離后分別檢測Dicer含量表明高表達的Dicer大部分進入細胞核。為了研究Dicer的作用機制，分別進行GST pull-down和co-IP實驗驗證了Dicer進入細胞核中與HP1α蛋白復合體結(jié)合互作，隨后作者對Dicer敲低后的細胞系檢測組蛋白的甲基化情況表明Dicer使染色體組蛋白甲基化。為了說明Dicer促進SFRP1啟動子甲基化，作者進行CHIP實驗驗證Dicer、HP1α、H3k9me3結(jié)合，并通過重亞硫酸鹽PCR檢測SFRP1啟動子的CpG島甲基化情況表明Dicer促進DNA甲基化。最后作者進行Dicer的細胞功能實驗驗證其對腫瘤進程的作用。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是腫瘤細胞Dicer特異表達然后進入細胞核與核內(nèi)的HP1α蛋白復合物互作。

A、 免疫組化檢測正常組織細胞和腫瘤細胞的Dicer，表明腫瘤細胞的Dicer表達量升高并且轉(zhuǎn)移到細胞核中。

B、 核質(zhì)分離檢測正常組織細胞系HIBEpic和腫瘤細胞系Hucct1、TFK1中的Dicer，表明腫瘤細胞的Dicer表達量升高并且細胞核含量比細胞質(zhì)含量高。

C、 GST-pulldown，分別表達純化GST-HP1α和GST-Dicer融合蛋白與細胞蛋白提取液孵育后用GST抗體釣取與標簽蛋白結(jié)合的蛋白，然后進行WB驗證，表明HP1α和Dicer有互作。

D、 Co-IP，分別用HP1α和Dicer從HIBEpic和Hucct1細胞中釣取與蛋白結(jié)合的蛋白進行WB驗證，表明HP1α和Dicer有互作。

E、 Co-IP，用HP1α抗體釣取細胞中與HP1α結(jié)合的蛋白，然后進行WB驗證，表明DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3與HP1α有互作。

Figure2說明的是Dicer調(diào)節(jié)膽管癌細胞的染色體修飾。

A、q-pcr檢測Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染后細胞系中Dicer Mrna的表達。

B-C、WB分別檢測Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細胞質(zhì)和細胞核中的Dicer含量，表明腫瘤細胞系的Dicer表達量總是高于正常組織細胞系表達量，并且細胞核含量高于細胞質(zhì)。

D、WB檢測Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的H3K9me3，表明腫瘤細胞Dicer敲低后組蛋白甲基化水平降低，而正常細胞系不受影響。

Figure3說明的是Dicer促進膽管癌細胞的SFRP1啟動子CpG島甲基化抑制SFRP1的表達。

A、 通過Dicer敲低慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后檢測幾種基因的甲基化水平。

B、 SFRP1啟動子CpG島以及進行CHIP和重亞硫酸鹽PCR的示意圖。

C、 CHIP實驗，檢測Dicer、HP1α、H3K9me3與SFRP1啟動子的結(jié)合。

D、 重亞硫酸鹽PCR檢測SFRP1啟動子DNA甲基化水平，表明腫瘤細胞DNA甲基化水平很高，Dicer敲低后DNA甲基化水平顯著降低，而正常細胞系的甲基化水平很低，Dicer敲低后不影響DNA的甲基化。

E、 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理和Dicer敲低后檢測SFRP1的mRNA，表明啟動子甲基化影響基因的轉(zhuǎn)錄。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進行類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達/敲低）、核質(zhì)分離、Q-PCR、GST pull-down、co-IP、CHIP，其中GST pull-down、co-IP、CHIP為本公司主營項目。

一、GST pull-down：驗證蛋白與蛋白互作的重要手段。

利用GST融合蛋白沉降技術(shù)，將靶蛋白與GST標簽蛋白在細菌體內(nèi)進行融合表達，純化獲取融合表達蛋白，與細胞蛋白提取液孵育，然后用標簽抗體釣取蛋白-蛋白復合物，復合物進行WB驗證。本實驗表明HP1α和Dicer有互作。

二、 CO-IP：確定兩種或多種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

本實驗用HP1α抗體釣取細胞內(nèi)與HP1α蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物用相應目的蛋白抗體進行WB驗證，表明了細胞內(nèi)HP1α與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3有互作。

三、 CHIP：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測。本實驗分別用HP1α、Dicer、H3k9me3抗體釣取與之結(jié)合的DNA片段，然后進行q-pcr檢測表明這些蛋白與SFRP1啟動子結(jié)合。

參考文獻：Wenlong Cheng,Yongqiang Qi,Li Tian,et al. Dicer promotes tumorigenesis by translocating to nucleus to promote SFRP1 promoter methylation in cholangiocarcinoma cells[J]. Cell Death and Disease,2017,8,e2628