Transcriptional and Epigenetic Regulation of KIF14 Overexpression in Ovarian Cancer

日期：2017-08-23 標(biāo)簽：Transcriptional,and,Epigenetic,Regulation,of,KIF14,Overexpression,in,Ovarian,Cancer

DNA甲基化研究案例（一）

一、調(diào)控通路

在正常細(xì)胞中，為了維持平衡，KIF14基因啟動(dòng)子的DNA是以甲基化狀態(tài)存在；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1結(jié)合到KIF14基因啟動(dòng)子上促使DNA去甲基化從而促進(jìn)KIF14的表達(dá)。另外，本文還簡(jiǎn)單的表明了miR-382抑制KIF14的表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)流程

作者首先通過(guò)熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了轉(zhuǎn)錄因子SP1、YY1的KIF14啟動(dòng)子活性的影響，然后建立SP1和YY1敲低細(xì)胞株檢測(cè)KIF14的表達(dá)；為了進(jìn)一步驗(yàn)證SP1、YY1與KIF14啟動(dòng)子的關(guān)系，作者先用CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SP1、YY1與啟動(dòng)子的結(jié)合，然后通過(guò)甲基化PCR實(shí)驗(yàn)說(shuō)明SP1和YY1促使KIF14啟動(dòng)子的DNA去甲基化；最后作者通過(guò)檢測(cè)KIF14高表達(dá)/低表達(dá)細(xì)胞中microRNA的表達(dá)和microRNA敲低后的KIF14 Mrna的表達(dá)簡(jiǎn)單的說(shuō)明miR-382抑制KIF14 mRNA的表達(dá)。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子互作影響該基因的表達(dá)。

A、 啟動(dòng)子熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，表明轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1影響KIF14啟動(dòng)子活性。

B、 Qpcr檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA的表達(dá)，表明SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA水平下降。

C、 WB檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1敲低后KIF14蛋白的表達(dá)，明SP1和YY1敲低后KIF14蛋白水平下降。

Figure2說(shuō)明的是轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1結(jié)合到KIF14啟動(dòng)子上促進(jìn)DNA去甲基化。

A、 CHIP實(shí)驗(yàn)，分別用轉(zhuǎn)錄因子蛋白SP1和YY1抗體釣取結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子高度結(jié)合。

B、 甲基化分析，用甲基化特異引物進(jìn)行q-PCR檢測(cè)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的KIF14啟動(dòng)子DNA甲基化情況，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞去甲基化程度上升。

Figure3說(shuō)明的是miR-382抑制KIF14的表達(dá)。

A、Q-PCR檢測(cè)KIF14高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞的microRNA，篩選出幾個(gè)差異表達(dá)的microRNA。

B、通過(guò)對(duì)micro的抑制檢測(cè)KIF14 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明miR-382受抑制后KIF14 mRNA表達(dá)上升，說(shuō)明miR-382可抑制KIF14的表達(dá)。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase檢測(cè)、CHIP、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過(guò)表達(dá)/敲低），其中的Luciferase檢測(cè)、CHIP為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、 Luciferase檢測(cè)：

作者分別將YY1、HSF1、SP1表達(dá)載體與KIF14啟動(dòng)子熒光素酶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后檢測(cè)熒光素酶活性。

二、 CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

作者分別用SP1和YY1抗體釣取細(xì)胞中與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，表明腫瘤細(xì)胞的SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子高度結(jié)合。

參考文獻(xiàn)：Brigitte L.The ′riault,Halesha D.Basavarajappa, Harvey Lim,et al.Transcriptional and Epigenetic Regulation of KIF14 Overexpression in Ovarian Cancer［J］.PLoS ONE,2014,9(3):e91540.