lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activation programs

日期：2017-08-18 標(biāo)簽：lncRNA-dependent,mechanisms,of,androgenreceptor-regulated,gene,activation,programs

轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)控研究案例（三）

一、    調(diào)控通路

DHT刺激細(xì)胞后，雄激素受體（AR）C-端與LncRNA PRNCR1結(jié)合，聯(lián)合另一個LncRNA PCGEM1招募DOT1L將AR的A-端甲基化；LncRNA PCGEM1同時與PYGO2結(jié)合，然后LncRNA將AR和PYGO2結(jié)合到靶標(biāo)基因的增強子區(qū)促進(jìn)基因的表達(dá)。

二、    實驗流程

作者首先用AR抗體進(jìn)行RIP實驗獲得了與AR結(jié)合的LncRNA PRNCR1和PCGEM1，又通過CHIRP實驗驗證了AR與LncRNA PCGEM1以及基因組蛋白的關(guān)系，RNA pull-down驗證LncRNA PRNCR1和PCGEM1結(jié)合AR；隨后作者通過一系列的RNA pull-down實驗驗證LncRNA PCGEM1與AR、PYGO2、DOT1L的互作關(guān)系；為了說明LncRNA PRNCR1和PCGEM1參與基因的轉(zhuǎn)錄過程，作者對LncRNA進(jìn)行敲低后檢測靶標(biāo)基因Mrna的表達(dá)；為了檢測AR與LncRNA的結(jié)合位點，作者使用RIP實驗進(jìn)行驗證；最后作者通過一系列的CHIP實驗驗證LncRNA、AR、PYGO2與靶基因啟動子、增強子的互作，作者對LncRNA敲低后細(xì)胞進(jìn)行CHIP實驗說明PYGO2的靶基因的作用是由LncRNA介導(dǎo)的。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是前列腺癌細(xì)胞特異LncRNA與雄激素受體（AR）的相互作用。

a-b、RIP實驗，用AR抗體釣取前列腺癌細(xì)胞和普通畸形前列腺增生細(xì)胞中AR結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，表明前列腺癌細(xì)胞的lncRNA PCNCR1和PCGEM1高度結(jié)合。

c、RIP實驗，用AR抗體釣取經(jīng)二氫睪酮處理后細(xì)胞中與AR結(jié)合的RNA，結(jié)果表明二氫睪酮誘導(dǎo)AR結(jié)合lncRNA PCNCR1和PCGEM1。

d、RIP實驗，用AR分別釣取PCNCR1敲低，PCGEM1敲低細(xì)胞中結(jié)合的RNA，結(jié)果表明PCNCR1敲低后兩種LncRNA與AR結(jié)合均下降，而PCGEM1敲低后，PCNCR1與AR的結(jié)合不受影響。

E、CHIRP實驗，細(xì)胞經(jīng)DHT處理后，用PCGEM1探針釣取與之結(jié)合的核酸和蛋白。

Figure2說明的是LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子/共激活物的互作。

a-b、RIP，對AR進(jìn)行突變，然后用Flag標(biāo)簽抗體釣取經(jīng)二氫睪酮處理后與AR結(jié)合的RNA，結(jié)果表明AR的K631/634Q突變后，LncRNA結(jié)合明顯增強，說明AR K631/634的乙?；?/span>LncRNA與AR相互作用增強。K349R突變后，PCGEM1結(jié)合降低表明AR結(jié)合PCGEM1需要K349的甲基化。

c、AR的體外甲基化實驗，DOT1L使AR甲基化。

d、RNA pull-down，將AR分為不同片段連接到表達(dá)載體上轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用PRNCR1探針做Pull down，結(jié)果表明PRNCR1結(jié)合AR的區(qū)段為549-623位氨基酸之間。

e、RNA pull-down，將AR分為不同片段連接到表達(dá)載體上，與DOT1L表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用PCGEM1探針做Pull down，結(jié)果表明在AR的K349甲基化后PCGEM1與AR的N-段結(jié)合。

f、RNA pull-down，用PCGEM1全長和截短探針釣取與之結(jié)合的蛋白，然后用WB檢測AR和PYGO2，表明PCGEM1結(jié)合AR的區(qū)段為411-490，結(jié)合PYGO2區(qū)段在1191-1270。

Figure3說明的是Lnc促使PRGO2和AR結(jié)合到靶標(biāo)基因的增強子區(qū)促進(jìn)基因表達(dá)。

A、q-pcr檢測AR表達(dá)，LncRNA敲低細(xì)胞的PSA等基因的表達(dá)，表明AR的表達(dá)促進(jìn)靶標(biāo)基因的表達(dá)，而LncRNA敲低后靶標(biāo)基因的表達(dá)下降。

B、CHIP-3C，表明PSA基因結(jié)合AR的區(qū)域。

C-D、CHIP，用PYGO2抗體釣取經(jīng)HDT處理的細(xì)胞與PYGO2結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR驗證，表明HDT處理后PYGO2結(jié)合到PSA基因的增強子區(qū)和啟動子區(qū)。

E、CHIP-3C，表明PYGO2敲低后，結(jié)合的PSA增強子減少。

F、CHIP，LncRNA敲低后，用AR抗體釣取與蛋白結(jié)合的DNA片段然后繼續(xù)Q-PCR檢測，表明LncRNA敲低后AR結(jié)合靶標(biāo)基因減少。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進(jìn)行類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括RNA pull-down、RIP、CHIRP、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、Q-PCR、CHIP，其中RIP、CHIRP、RNA pull-down、CHIP為本公司主營項目。

一、RIP：主要--研究蛋白與RNA的相互作用

作者分別用AR抗體釣取細(xì)胞中與AR蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr驗證，結(jié)果表明LncRNA PRNCR1和PCGEM1與AR結(jié)合。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

二、CHIRP：檢測與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。

在本實驗中，作者用PCGEM1探針釣取經(jīng)DHT處理后的細(xì)胞中與PCGEM1結(jié)合的蛋白和DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR和WB檢測。

三、RNA pull-down：檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。

 用PRNCR1探針釣取純化的MYC-標(biāo)簽的AR融合蛋白，然后進(jìn)行WB驗證，結(jié)果表明了LncRNA PRNCR與AR直接結(jié)合，結(jié)合的AR區(qū)域為549-623位氨基酸區(qū)域。我公司在實驗體系中同時提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、CHIP：主要研究蛋白與基因啟動子之間的關(guān)系

 用PYGO2抗體釣取細(xì)胞內(nèi)與PYGO2蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，結(jié)果表明DHT刺激后PYGO2結(jié)合PSA基因的增強子區(qū)和啟動子區(qū)，LncRNA干擾表達(dá)后結(jié)合降低。

參考文獻(xiàn)：Liuqing Yang, Chunru Lin, Chunyu Jin,et al. lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activation programs［J］.Nature,2013,500(7464): 598–602