The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer

日期：2017-08-16 標(biāo)簽：The,LINK-A,lncRNA,activates,normoxic,HIF1α,signalling,in,triple-negative,breast,cancer

轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)控研究案例（二）

一、調(diào)控通路

LncRNA LINK-A在細(xì)胞質(zhì)中與蛋白BRK、LRRK2結(jié)合，當(dāng)有胞外因子刺激時(shí)，LINK-A與蛋白復(fù)合物接收EGFR/GPNMB信號(hào)然后與轉(zhuǎn)錄因子HIF1結(jié)合，BRK將HIF1的Tyr 565磷酸化，LRRK2將HIF1的Ser 797磷酸化，HIF1磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核與P300共同作用于癌相關(guān)基因的啟動(dòng)子促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)流程

作者首先通過(guò)檢測(cè)三陰乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的LINK-A表達(dá)驗(yàn)證在三陰乳腺癌中LINK-A高表達(dá)確定本文的主角；為了驗(yàn)證LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結(jié)合，作者分別進(jìn)行RNA pull-down、RIP、dot-blot驗(yàn)證并找出了與這兩種蛋白結(jié)合的RNA位點(diǎn)；EGFR/GPNMB信號(hào)通路的激活：作者分別用RNA pull-down、co-IP、純化標(biāo)簽融合蛋白的co-IP等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了胞外因子HB-EGF刺激信號(hào)通路使HIF1磷酸化；用FISH、RIP和胞外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HB-EGF刺激使細(xì)胞中EGFR/GPNMB與LINK-A、BRK/LRRK2互作；用體外激酶實(shí)驗(yàn)和各種WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIF1的磷酸化位點(diǎn)；作者先用co-IP驗(yàn)證HIF1與P300的互作，再通過(guò)對(duì)LINK-A進(jìn)行BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)的突變檢測(cè)HIF1的磷酸化和P300的結(jié)合來(lái)說(shuō)明磷酸化的HIF1與P300互作是通過(guò)LINK-A與BRK、LRRK2結(jié)合后介導(dǎo)的；最后作者通過(guò)CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證磷酸化的HIF1結(jié)合到靶標(biāo)基因啟動(dòng)子上促進(jìn)基因的表達(dá)。

三、核心FIGURE：

     Figure1說(shuō)明的是LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結(jié)合，并找到的與蛋白結(jié)合的RNA位點(diǎn)。

A、RNA pull-down，用LncRNA Link-A探針釣取細(xì)胞內(nèi)與之結(jié)合的蛋白，聯(lián)用質(zhì)譜分析。

B、RIP實(shí)驗(yàn)，用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)驗(yàn)證Link-A與這兩種蛋白高度結(jié)合。

C-D、RNA pull-down，用LINK-A探針分別與純化的帶FLAG標(biāo)簽融合蛋白BRK和帶MYC標(biāo)簽的融合蛋白LRRK2孵育釣取結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行WB檢測(cè)表明LINK-A直接與BRK以及LRRK2蛋白結(jié)合。

E、斑點(diǎn)印跡雜交，體外將生物素標(biāo)記的LINK-A與標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合然后進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè)LINK-A與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)段。

F、RNA pull-down，用LINK-A全長(zhǎng)和去除斑點(diǎn)印跡法檢測(cè)到的與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的突變探針釣取蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證LINK-A與蛋白的結(jié)合區(qū)段。

   Figure2說(shuō)明的是HB-EGF誘導(dǎo)LINK-A-蛋白復(fù)合體與信號(hào)通路蛋白EGFR/GPNMB結(jié)合，并促使HIF1磷酸化。

A、              RNA pull-down，細(xì)胞經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)后，用LINK-A探針釣取RNA結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，表明HB-EGF刺激使LINK-A結(jié)合蛋白GPNMB、BRK、HIF1等。

B、WB，分別用EGFR和GPNMB抗體檢測(cè)經(jīng)生長(zhǎng)因子處理后的細(xì)胞蛋白，結(jié)果表明HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結(jié)合。

C、Co-IP，用EGFR釣取經(jīng)各種胞外因子處理后細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測(cè)，表明經(jīng)HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結(jié)合。

D-E、分別用純化的帶標(biāo)簽融合蛋白EGFR和GPNMB釣取經(jīng)HB-EGF處理后細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證表明EGFR與GPNMB直接結(jié)合。

F、Co-IP，分別用BRK、GPNMB和HIF1蛋白抗體釣取經(jīng)胞外因子處理后細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后用HIF1磷酸化抗體進(jìn)行WB檢測(cè)，結(jié)果表明HB-EGF誘導(dǎo)HIF1磷酸化。

G、體外激酶實(shí)驗(yàn)，表明GPNMB被磷酸化。

H、用純化的GPNMB帶釣取經(jīng)HB-EGF處理后中與之結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測(cè)，表明HB-EGF處理后BRK與GPNMB結(jié)合并被磷酸化。

   Figure3說(shuō)明的是HB-EGF誘導(dǎo)細(xì)胞EGFR/GPNMB與BRK、LRRK2互作。

A、FISH，分別對(duì)LINK-A敲低細(xì)胞經(jīng)HB-EGF處理后的細(xì)胞中EGFR和BRK進(jìn)行定位，表明HB-EGF處理使這兩種代表有互作。

   B、LINK-A與蛋白BRF、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)信息。

C、RIP，分別用LINK-A全長(zhǎng)和去除蛋白結(jié)合位點(diǎn)的探針釣取細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白，然后用磷酸化的蛋白抗體進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明GPNMB和BRK磷酸化并驗(yàn)證了B圖所示的結(jié)合位點(diǎn)。

D、FISH，表明HB-EGF處理后的細(xì)胞中EGFR和磷酸化的BRK互作。

E-F、體外激酶實(shí)驗(yàn)。

G、體外RNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，用完整蛋白和去除部分組分的蛋白與LINK-A全長(zhǎng)和去除蛋白結(jié)合位點(diǎn)的RNA進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

      Figure4說(shuō)明的是HB-EGF激活信號(hào)通路BRK促進(jìn)HIF1 Tyr565位點(diǎn)磷酸化，HIF1 Tyr565的磷酸化使Pro564羥基化。

A、體外激酶實(shí)驗(yàn)，表明HIF1的磷酸化位點(diǎn)為Tyr565和Ser797。

B、體外激酶實(shí)驗(yàn)，BRK促進(jìn)HIF1 Tyr565位點(diǎn)磷酸化。

C、WB檢測(cè)HB-EGF誘導(dǎo)各種蛋白磷酸化情況。

     D-F、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的各種蛋白磷酸化情況。

G、HB-EGF處理細(xì)胞不同時(shí)間后檢測(cè)HIF1 Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基化。

H、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的HIF1 Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基化。

I、各種蛋白敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的HIF1 Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基化。

   Figure5說(shuō)明的是LINK-A促進(jìn)HIF1磷酸化，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子HIF1與P300互作促進(jìn)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。

A、co-IP，用HIF1抗體釣取LINK-A和LRRK2敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后用WB驗(yàn)證，表明磷酸化的HIF1與P300結(jié)合。

B、co-IP，用純化的帶標(biāo)簽融合HIF1和Ser797位點(diǎn)突變的HIF1與細(xì)胞總蛋白孵育，然后用標(biāo)簽抗體釣取結(jié)合蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明Ser797位點(diǎn)突變的HIF1不能與P300結(jié)合。

C、將LINK-A全長(zhǎng)和BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)突變的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，然后檢測(cè)經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)后的磷酸化的HIF1，表明LINK-A的BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)突變后，HIF1不能磷酸化。

D-E、CHIP-seq，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細(xì)胞中與之結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行高通量測(cè)序，C為HIF1結(jié)合的DNA富集motif，D為結(jié)合的靶標(biāo)。

F、CHIP-q-pcr，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細(xì)胞中與之結(jié)合的DNA片段然后進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，表明HB-EGF促進(jìn)HIF1與靶標(biāo)基因啟動(dòng)子結(jié)合。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目

本公司可進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括RNA pull-down、RIP、WB、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過(guò)表達(dá)/敲低）、Q-PCR、FISH、CHIP，其中RNA pull-down、FISH、RIP、CHIP為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、RNA pull-down：檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。

本實(shí)驗(yàn)作者用LINK-A探針釣取經(jīng)HB-EGF處理后的細(xì)胞裂解液中與之結(jié)合的蛋白，pull-down產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析，篩選出HB-EGF誘導(dǎo)結(jié)合的蛋白。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中同時(shí)提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

二、   RIP：主要--研究蛋白與RNA的相互作用

分別用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取細(xì)胞中與蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

三、Co-IP：檢測(cè)蛋白與蛋白的互作。

 用EGFR蛋白抗體釣取經(jīng)不同胞外因子處理后細(xì)胞中與EGFR結(jié)合的蛋白，產(chǎn)物進(jìn)行WB驗(yàn)證，結(jié)果表明HB-EGF促進(jìn)EGFR與GPNMB結(jié)合。

三、FISH：免疫熒光原位雜交，對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白的定位。

作者用免疫熒光原位雜交對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白EGFR和BRK進(jìn)行定位，結(jié)果表明經(jīng)HB-EGF處理后細(xì)胞內(nèi)EGFR與BRK互作。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

四、CHIP：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

用HIF1抗體釣取LINK-A敲低細(xì)胞經(jīng)HB-EGF處理后與HIF1結(jié)合的DNA片段，產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明LINK-A敲低后HIF1結(jié)合靶標(biāo)基因啟動(dòng)子下降，說(shuō)明LINK-A在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因啟動(dòng)子的重要作用。

參考文獻(xiàn)：Aifu Lin1,Chunlai Li1, Zhen Xing,et al. The LINK-A lncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer［J］. NATURE CELL BIOLOGY,2016, 10.1038/ncb3295