CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer

日期：2017-08-15 標(biāo)簽：CCAT2

轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)調(diào)控研究案例（一）

一、調(diào)控通路

LncRNA CCAT2由rs69x3267snp基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，CCAT2的表達(dá)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2并將其結(jié)合到靶標(biāo)基因啟動(dòng)子上促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄為RNA，這些靶標(biāo)基因編碼與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，同時(shí)轉(zhuǎn)錄的RNA經(jīng)剪切加工后可產(chǎn)生miR-17-5p。

二、實(shí)驗(yàn)流程

作者首先用Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌病人樣本中結(jié)腸癌細(xì)胞和癌旁組織細(xì)胞的LncRNA表達(dá)，表明LncRNA CCAT2在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，然后用原位雜交驗(yàn)證LncRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)從而確定了本文的主角LncRNA CCAT2。隨后作者對(duì)CCAT2分別進(jìn)行功能研究和作用機(jī)制研究。（1）功能研究：作者建立CCAT2的過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行小鼠體內(nèi)成瘤試驗(yàn)和細(xì)胞遷移試驗(yàn)，建立CCAT2敲低穩(wěn)定株進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和基因不穩(wěn)定性檢測(cè)說明CCAT2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。（2）機(jī)制研究：機(jī)制研究可分為兩個(gè)方面，一是在較大的方向上說明CCAT2促進(jìn)MYC和miR-17-5p的表達(dá)，二是說明CCAT2通過招募轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)MYC和miR-17-5p表達(dá)。作者首先用Q-PCR和WB檢測(cè)CCAT2過表達(dá)/敲低細(xì)胞的MYC的表達(dá)說明CCAT促進(jìn)MYC基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，用q-pcr檢測(cè)CCAT2過表達(dá)后microRNA的表達(dá)說明CCAT2促進(jìn)miR-17-5p的表達(dá)，通過添加microRNA的反向互補(bǔ)序列檢測(cè)細(xì)胞的遷移，說明miR-17-5a促進(jìn)細(xì)胞遷移。作者用Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞核質(zhì)分離后的CCAT2表明CCAT2在細(xì)胞核內(nèi)，隨后通過CHIP和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CCAT2和轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2與Myc啟動(dòng)子結(jié)合，然后用FISH檢測(cè)CCAT2過表達(dá)細(xì)胞的MYC表達(dá)等一系列實(shí)驗(yàn)說明CCAT2通過招募轉(zhuǎn)錄因子激活基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)蛋白表達(dá)。最后作者檢測(cè)CCAT2過表達(dá)后的CD44和vim mRNA說明CCAT2促進(jìn)這兩種基因轉(zhuǎn)錄。

三、核心FIGURE

FIGURE1說明的是LncRNA CCAT2促進(jìn)MYC、miR-17-5p、miR-20a的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。

A、     分別用WB和Q-PCR檢測(cè)CCAT2過表達(dá)后的MYC表達(dá)，表明CCAT2過表達(dá)促使MYC表達(dá)升高。

B、     Q-pcr檢測(cè)CCAT2過表達(dá)后的microRNA的表達(dá)，結(jié)果表明CCAT2過表達(dá)使miR-17-5p和miR-20a表達(dá)升高，miR-146a表達(dá)下降。

C、     別用WB和Q-PCR檢測(cè)CCAT2敲低后的MYC表達(dá)，表明CCAT2敲低促使MYC表達(dá)下降。

D、     通過添加microRNA的反向互補(bǔ)序列檢測(cè)細(xì)胞的遷移，表明miR-17-5a和miR-20a的互補(bǔ)序列使細(xì)胞遷移能力下降。說明miR-17-5a和miR-20a促進(jìn)細(xì)胞遷移。

     Figure2說明的是CCAT2結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2到MYC等基因啟動(dòng)子上促進(jìn)表達(dá)。

A、     核質(zhì)分離后，q-pcr檢測(cè)CCAT2，表明CCRT2在細(xì)胞核內(nèi)。

B、     CHIP實(shí)驗(yàn)，用轉(zhuǎn)錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)，表明TCF7L2與MYC啟動(dòng)子結(jié)合。

C、     RIP實(shí)驗(yàn)，用轉(zhuǎn)錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結(jié)合的RNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測(cè)，表明TCF7L2與lncRNA CCAT2結(jié)合。

D、     蛋白FISH，用熒光免疫原位雜交檢測(cè)CCAT2過表達(dá)細(xì)胞的波形蛋白，表明CCAT2過表達(dá)細(xì)胞的波形蛋白信號(hào)很強(qiáng)。

E、     Q-PCR檢測(cè)CCAT2過表達(dá)后的CD44和波形蛋白mRNA的表達(dá)。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括Q-PCR、Western Blot、CHIP實(shí)驗(yàn)、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、RIP實(shí)驗(yàn)等，其中的CHIP實(shí)驗(yàn)、RIP、蛋白FISH為本公司主營(yíng)項(xiàng)目。

一、 CHIP實(shí)驗(yàn)：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)作者用轉(zhuǎn)錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與蛋白結(jié)合的DNA片段，然后用Q-PCR檢測(cè)CHIP產(chǎn)物是否含有MYC啟動(dòng)子序列，說明了TCF7L2與MYC啟動(dòng)子結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

二、RIP實(shí)驗(yàn)，主要研究蛋白與RNA的相互作用。

本實(shí)驗(yàn)作者用轉(zhuǎn)錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA片段，然后用Q-PCR檢測(cè)RIP產(chǎn)物,說明了TCF7L2與LncRNA CCAT2結(jié)合。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，進(jìn)一步排除系統(tǒng)誤差。

   三、蛋白FISH，即蛋白免疫熒光原位雜交：細(xì)胞內(nèi)蛋白的定性、定位和定量。

本實(shí)驗(yàn)作者用熒光免疫原位雜交檢測(cè)CCAT2過表達(dá)細(xì)胞的波形蛋白，表明CCAT2過表達(dá)細(xì)胞的波形蛋白信號(hào)很強(qiáng)，說明CCAT2過表達(dá)促進(jìn)波形蛋白表達(dá)。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中設(shè)置陰性和陽性對(duì)照。

參考文獻(xiàn)：Hui Ling,Riccardo Spizzo,Yaser Atlasi,et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer［J］. Genome Research, 2013,23:1446–1461