Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B

日期：2017-09-13 標簽：糖皮質(zhì)激素間接誘導microRNA-708以RaplB為靶標抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移

mRNA翻譯調(diào)控研究案例（二）

一、調(diào)控通路

MicroRNA-708在卵巢癌細胞中表達量很低，當細胞受到糖皮質(zhì)激素（GC）的刺激后，GC誘導GRα結(jié)合到miR-708的啟動子區(qū)促進miR-708的表達，隨后miR-708與Rap-1B mRNA的3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制mRNA翻譯表達，Rap-1B是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要標志蛋白，Rap-1B表達受到抑制后會抑制細胞的轉(zhuǎn)移。

二、實驗流程

作者首先通過microRNA的表達微陣列和用q-pcr檢測microRNA708的表達篩選出在轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞中異常低表達的miR-708，后續(xù)研究就是圍繞miR-708進行。對miR-708的研究作者分別進行功能和機制的研究：（1）功能實驗：將miR-708和miR-708+anti轉(zhuǎn)染細胞后檢測細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲以及小鼠體內(nèi)實驗說明miR-708能抑制卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移。（2）機制實驗核心包括三個部分的內(nèi)容，一是miR-708的表達調(diào)控：作者用DEX處理細胞后檢測miR-708和Odz2 RNA的表達說明miR-708和Odz2共轉(zhuǎn)錄形成；然后通過ChIP實驗說明糖皮質(zhì)激素誘導GRα結(jié)合到MIR708基因啟動子上促進miR-708的表達。二是通過熒光素酶實驗驗證MiR-708與Rap1B Mrna的3’-UTR互作抑制Rap1B的表達。

三、核心FIGURE

Figure1說明的是糖皮質(zhì)激素信號誘導GR與miR-708和ODZ4基因啟動子結(jié)合促進基因的轉(zhuǎn)錄。

A、 用DEX處理細胞后檢測ODZ4和miR-708的表達，表明DEX處理使ODZ4和miR-708的表達都升高。

B、 對GRα敲低后檢測ODZ2和miR-708的表達，表明ODZ2和miR-708的表達受GRα的調(diào)控。

C、 分別用DEX和CHX處理細胞后檢測ODZ2和miR-708的表達，表明DEX使ODZ2和miR-708的表達上升。

D、 ODZ2和miR-708的基因組上的位置示意圖，ODZ2和miR-708共轉(zhuǎn)錄形成。

E-F、ChIP實驗，用DEX處理細胞后用H3和GR抗體獲取與蛋白結(jié)合的DNA片段然后進行q-pcr檢測，表明DEX促進GR與ODZ2啟動子結(jié)合。

Figure2說明的是miR-708以Rqp1B mRNA的3’-UTR為靶標抑制蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

A、 維恩圖，預測的與Rqp1B相關(guān)的microRNA。

B-C、用miR-708、miR-708+anti轉(zhuǎn)染細胞后，檢測Rqp1B mRNA和蛋白的表達，表明miR-708抑制Rqp1B的表達。

D、 熒光素酶實驗，將Rqp1B mRNA 3’-URT序列連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上與miR-708共轉(zhuǎn)染細胞后檢測熒光素酶活性，表明miR-708通過與Rqp1B mRNA 3’-URT互作抑制蛋白的表達。

E、 分別對Rqp1B和Rqp1A敲低后檢測細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，表明Rqp1敲低降低細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

F、 用DEX處理細胞后檢測Rqp1B、pGRα和GRα的表達，表明DEX使Rqp1B表達降低而使pGRα升高。

Figure3說明的是miR-708抑制細胞粘附因子的形成，而Rqp1B促進細胞粘附因子的形成。

A、 蛋白-FISH，分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞后與FN粘連然后檢測細胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成降低。

B、 分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞后檢測磷酸化的樁蛋白和焦粘附激酶，表明miR-708和Rqp1B敲低使磷酸化的樁蛋白和焦粘附激酶降低。

C、 檢測細胞的粘附性。

D、 蛋白-FISH，分別將miR-708與HA-Rqp1B重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后檢測Paxillin和b-actin，表明miR-708使黏附因子形成降低，Rqp1B表達使粘附因子形成升高。

E-G、細胞粘附因子形成統(tǒng)計。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進行以上類似實驗的實驗設(shè)計及整體實驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、ChIP、Luciferase檢測、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（敲低）、FISH，其中的Luciferase檢測、CHIP和FISH為本公司主營項目。

一、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因之間的關(guān)系。

用DEX處理細胞后用H3和GR蛋白抗體獲取細胞中與相應(yīng)蛋白結(jié)合的DNA片段，然后進行q-pcr檢測，表明DEX處理后細胞的GR與MIR708啟動子結(jié)合上升。我公司在實驗體系中設(shè)置陽性及陰性對照，進一步排除系統(tǒng)誤差。

二、Luciferase檢測：驗證microRNA與靶標3’-UTR的互作。

分別將Rap1B Mrna的3’-UTR序列和其突變序列連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與miR-708和miR-708+anti708共轉(zhuǎn)染細胞后檢測細胞的熒光素酶活性，表明miR-708與Rap1B 3’-UTR互作抑制熒光素酶活性。

三、FISH：免疫熒光原位雜交技術(shù)，對蛋白、RNA、DNA進行細胞內(nèi)的定位、定量。

分別將MiR-708與Rqp1B敲低質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞后與FN粘連然后檢測細胞中的Paxillin和b-actin，表明miR-708和Rqp1B敲低使黏附因子形成。

參考文獻：Kai-Ti Lin,Yu-Ming Yeh,Chi-Mu Chuang,et al. Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B[J].NATURE COMMUNICATIONS,2014,6:5917