A Long Non-coding RNA ，LncMyoD ，Regulates SKeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation

日期：2017-07-15 標(biāo)簽：LncMyoD

mRNA翻譯調(diào)控研究案例（一）

（一）調(diào)控通路圖：

    MyoD結(jié)合到LncRNA MyoD啟動(dòng)子上促進(jìn)LncRNA MyoD的表達(dá)，然后LncRNA MyoD通過與mRNA結(jié)合蛋白IMP2結(jié)合，使其不能結(jié)合到mRNA上，從而抑制mRNA的翻譯。

（二）實(shí)驗(yàn)流程：

作者首先通過分化的骨骼肌細(xì)胞和未分化細(xì)胞的RNA-seq分析篩選出LncRNA MyoD,然后進(jìn)行q-pcr驗(yàn)證在肌小管細(xì)胞中LncMyoD高表達(dá)。隨后對(duì)LncMyoD進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)和調(diào)控機(jī)制研究。

LncMyoD功能研究：首先建立LncMyoD過表達(dá)/敲低穩(wěn)定細(xì)胞株，檢測(cè)過表達(dá)/敲低后的與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖分化檢測(cè)。

調(diào)控機(jī)制研究：（1）蛋白MyoD與LncMyoD啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)LncMyoD表達(dá)，作者用CHIP和啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩者的關(guān)系。（2）LncMyoD結(jié)合Mrna結(jié)合蛋白IMP2抑制靶標(biāo)mRNA表達(dá)：先用RNA pull-down和RIP驗(yàn)證LncMyoD與IMP2結(jié)合，然后對(duì)LncMyoD敲低后的細(xì)胞分別用QRT-PCR和WB檢測(cè)靶標(biāo)mRNA和蛋白的表達(dá)，用IMP2抗體在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)合的RNA，表明LncMyoD與IMP2靶標(biāo)mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IMP2。

（三）核心FIGURE：

Figure1說明的是MyoD蛋白結(jié)合的LncMyoD的啟動(dòng)子上并促進(jìn)LncMyoD的表達(dá)。

A、通過MyoD蛋白的過表達(dá)和敲低，用 qRT-PCR檢測(cè)LncMyoD的表達(dá)情況。表明MyoD促進(jìn)LncRNA MyoD的表達(dá)。

B、通過熒光素酶驗(yàn)證LncMyoD啟動(dòng)子受MyoD的誘導(dǎo)激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。

C、CHIP實(shí)驗(yàn)，用蛋白MyoD抗體釣取與MyoD結(jié)合的DNA片段，聯(lián)用Q-PCR檢測(cè)蛋白與LncMyoD啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域。結(jié)果表明MyoD結(jié)合到LncRNA MyoD啟動(dòng)子的Primer1和Primer4區(qū)域。

Figure2說明的是LncMyoD與IMP2靶標(biāo)mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IMP2從而降低這些靶標(biāo)基因的表達(dá)。

A、 RNA pull-down，用LncMyoD探針釣取與LncMyoD結(jié)合的蛋白，用IMP2抗體進(jìn)行WB驗(yàn)證LncMyoD與蛋白IMP2結(jié)合。

B、 RIP用IMP2抗體從LncMyoD敲低和未敲低細(xì)胞中釣取與IMP2結(jié)合的RNA，用Q-PCR檢測(cè)RIP產(chǎn)物，結(jié)果表明LncMyoD敲低后與IMP2結(jié)合下降。

C、 RIP，用IMP2抗體從LncMyoD敲低和未敲低細(xì)胞中釣取與IMP2結(jié)合的RNA，用Q-PCR檢測(cè)產(chǎn)物中的IMP2靶標(biāo)mRNA，結(jié)果表明LncMyoD敲低后，IMP2與其靶標(biāo)Mrna的結(jié)合上升。

D、 RIP，用IMP2抗體在不同時(shí)間點(diǎn)從細(xì)胞中釣取與IMP2結(jié)合的RNA，然后檢測(cè)產(chǎn)物中的相關(guān)RNA，表明LncMyoD與IMP2靶標(biāo)mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IMP2。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目

本公司可進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及整體實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目，包括Q-PCR、慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立（過表達(dá)/敲低）、Luciferase檢測(cè)、CHIP、RNA pull-down、WB、RIP，其中Luciferase檢測(cè)、CHIP、RNA pull-down、RIP為本公司主營項(xiàng)目。

一、Luciferase檢測(cè)：檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合的重要手段

本實(shí)驗(yàn)用MyoD蛋白表達(dá)質(zhì)粒和LncMyoD啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)啟動(dòng)子活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著MyoD表達(dá)升高LncMyoD啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，說明了MyoD對(duì)LncMyoD啟動(dòng)子的激活。證明了MyoD對(duì)LncMyoD啟動(dòng)子的激活作用。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LncMyoD啟動(dòng)子與MyoD結(jié)合的區(qū)域。用MyoD抗體進(jìn)行CHIP獲取與MyoD蛋白結(jié)合的DNA片段，然后用LncMyoD啟動(dòng)子不同區(qū)段的引物進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，說明了LncMyoD啟動(dòng)子與MyoD結(jié)合的區(qū)域在P1和P1區(qū)域。

三、RNA pull-down：檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。

       本實(shí)驗(yàn)用LncMyoD探針釣取與RNA結(jié)合的蛋白，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行WB驗(yàn)證，說明了LncMyoD與IMP2的結(jié)合關(guān)系。我公司在實(shí)驗(yàn)體系中同時(shí)提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、RIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

   用IMP2抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)獲取不同時(shí)期與IMP2結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)產(chǎn)物中的RNA，隨時(shí)間推移與IMP2結(jié)合的LncMyoD呈上升趨勢(shì)，而IMP2的靶標(biāo)mRNA結(jié)合越來越少，說明了LncMyoD競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合IMP2是IMP2不能結(jié)合到靶標(biāo)mRNA上。

參考文獻(xiàn)：Chenguang Gong, Zhizhong Li, Krishnan Ramanujan，et al.A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation［J］. Developmental Cell,2015,34, 181–191