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3D模型驗(yàn)證技術(shù)

    基因組模型構(gòu)建完成后，我們需要對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。主要從兩個(gè)方面對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，一個(gè)是模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，一個(gè)是對(duì)模型功能進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)模型結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，我們也是從兩個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證，一個(gè)利用DNA FISH對(duì)模型的空間定位進(jìn)行研究，一個(gè)是利用3C對(duì)模型的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)模型的功能驗(yàn)證，我們主要利用CRISPR技術(shù)去除模型結(jié)構(gòu)，觀察對(duì)應(yīng)基因及細(xì)胞代謝的變化。

1.DNA FISH-模型空間定位驗(yàn)證                                    

    DNA FISH的基本流程與RNA及蛋白FISH相似，但DNA FISH探針要求更加嚴(yán)格，且細(xì)胞內(nèi)的DNA及探針均需要變性。DNA FISH是觀察細(xì)胞核中DNA分步，這需要更高放大倍數(shù)的共聚焦顯微鏡。

    如下圖所示，在母本染色體中，三個(gè)基因是分開的，在父本染色體中，3個(gè)基因經(jīng)過(guò)環(huán)形折疊在一起。

2.3C-模型空間結(jié)構(gòu)驗(yàn)證                                           

    3C的基本流程如下圖所示。染色質(zhì)先進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后酶切，連接，再進(jìn)行QPCR檢測(cè)。3C技術(shù)主要捕獲的是兩基因間的互作，因此這種技術(shù)常用來(lái)驗(yàn)證基因間的互作。

    下圖所描述的是基因promoter區(qū)與增強(qiáng)子區(qū)的互作驗(yàn)證，我們可以看到FIP1L1與914kb處的增強(qiáng)子有互作。

3.CRISPR-模型功能驗(yàn)證                                          

    我們利用CRISPR 技術(shù)敲掉CTCF motif，使CTCF無(wú)法結(jié)合，基因組的3D結(jié)構(gòu)模型被破壞，相應(yīng)基因的表達(dá)受到影響，細(xì)胞功能也可能會(huì)受到影響。CRISPR的功能是強(qiáng)大的，您可以根據(jù)您的需要敲除增強(qiáng)子，沉默子，絕緣子，甚至基因。

CTCF位點(diǎn)被定點(diǎn)敲除

酶切檢測(cè)敲除效率

PCR檢測(cè)位點(diǎn)敲除后的基因變化

位點(diǎn)敲除后的功能檢測(cè)

• 1 . 3D基因組概述
  • 1.1. 染色質(zhì)拓普結(jié)構(gòu)
  • 1.2. 基因組的結(jié)構(gòu)構(gòu)成
• 2 . 3D基因組模型研究
  • 2.1. 3D基因組的調(diào)控模型
  • 2.2. 3D模型構(gòu)建實(shí)例
• 3 . 3D基因組主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)
  • 3.1. 3D基因組之ChIP-seq
  • 3.2. 3D基因組之Hi-C
  • 3.3. 3D基因組之模型驗(yàn)證