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實(shí)驗(yàn)問題與解決方案
◆1怎樣避免sgRNA脫靶?
脫靶效應(yīng)與sgRNA的精確設(shè)計(jì)有著密切的關(guān)系，一般的sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站都會(huì)給出設(shè)計(jì)序列相應(yīng)的脫靶位點(diǎn)、GC含量或綜合得分，我們一定要選擇綜合得分高和脫靶位點(diǎn)少的sgRNA序列，且一般至少設(shè)計(jì)3條sgRNA。
◆2怎樣選擇CRISPR系統(tǒng)？
如果要靶標(biāo)多個(gè)基因位點(diǎn)，建議您選擇CRISPR-cpf1系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上，一個(gè)sgRNA載體可同時(shí)插入多個(gè)sgRNA。
如果要更精確的編譯基因組，建議選擇Cas9 nicknase，這個(gè)蛋白是Cas9的突變體，只切割DNA的一條鏈，因此，這個(gè)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA，同時(shí)切割，才能產(chǎn)生DNA雙鏈缺口。同時(shí)，這種方法大大降低了脫靶效應(yīng)。
◆3 Cas9的單切系統(tǒng)和雙切系統(tǒng)是什么？
Cas9的雙切系統(tǒng)是未突變的Cas9內(nèi)切酶，Cas9內(nèi)切酶可以切割雙鏈DNA。Cas9
的單切系統(tǒng)使用的是單突變Cas9內(nèi)切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要兩套才可以切割雙鏈DNA。
◆4 怎樣選擇CRISPR系統(tǒng)的質(zhì)粒？
如果您的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，可使用普通載體，如果您的細(xì)胞不容易轉(zhuǎn)染，建議使用腺病毒或慢病毒載體。
