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CRISPR-dCas9實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)步驟 ：  

1.設(shè)計(jì)sgRNA

  按照“20N+NGG(PAM)”的設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)sgRNA，至少設(shè)計(jì)3條。

2.構(gòu)建sgRNA和dCas9-target 質(zhì)粒

3.構(gòu)建dCas9-target穩(wěn)轉(zhuǎn)株

  穩(wěn)轉(zhuǎn)株蛋白構(gòu)建完成后，用flag抗體或目的蛋白抗體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株是否構(gòu)建成功，如果載體上有熒光蛋白，可用熒光檢測(cè)細(xì)胞株是否構(gòu)建成功。

圖3 熒光檢測(cè)圖片  A轉(zhuǎn)染篩選后明場(chǎng)圖片   B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細(xì)胞

4.Flag-ChIP-QPCR驗(yàn)證sgRNA的工作效率

  將sgRNA轉(zhuǎn)染至dCas9-target穩(wěn)轉(zhuǎn)株中，ChIP檢測(cè)sgRNA的工作效率。

• 1 . CRISPR-Cas9系統(tǒng)
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機(jī)制
  • 1.3. 不同的Cas9系統(tǒng)
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統(tǒng)
• 2 . CRSPER- dCas9系統(tǒng)
  • 2.1. dCas9-轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統(tǒng)
  • 2.3. dcas9-表觀遺傳系統(tǒng)
• 3 . dCas9技術(shù)路線
  • 3.1. gRNA設(shè)計(jì)
  • 3.2. dCas9實(shí)驗(yàn)流程
  • 3.3. 實(shí)驗(yàn)問題與解決方案