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CRISPR dCas9—基因激活與抑制系統(tǒng)
dCas9系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因的激活或抑制
dCas9-SAM-CRISPR Cas9 基因激活系統(tǒng)
在第一代dCas9-SAM系統(tǒng)中，dCas9與典型的轉(zhuǎn)錄激活因子如VP64（單純性皰疹病毒蛋白16的合成四聚體）或p65（參與許多細(xì)胞過程的轉(zhuǎn)錄因子）融合。這個(gè)系統(tǒng)可以在多種真核細(xì)胞的全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。
為了增強(qiáng)激活能力，開發(fā)了二代dCas9-SAM系統(tǒng)。該系統(tǒng)建立在基本的dCas9-VP64結(jié)構(gòu)上，但其中的sgRNA是經(jīng)修飾過的，可以募集額外的轉(zhuǎn)錄激活因子以達(dá)成協(xié)同激活作用。這種修飾的sgRNA包含了兩段可結(jié)合噬菌體MS2外殼蛋白二聚體的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 MS2蛋白與另外的活化劑如p65和人熱休克因子1（HSF1）融合，這使得每個(gè)dCas9分子可以募集13個(gè)活化分子（圖2a）。這個(gè)新的dCas9-SAM系統(tǒng)可以可靠地將基因表達(dá)從10倍增加到幾千倍（圖2b）。由于這個(gè)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)修飾的sgRNA，人們開發(fā)了第三代dCas9-SAM系統(tǒng)，也稱為dCas9-VPR系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，這大大簡化了設(shè)計(jì)過程。當(dāng)與sgRNA文庫結(jié)合使用時(shí)，該系統(tǒng)還能夠支持大規(guī)模的全基因組功能激活，使其成為研究生物學(xué)過程和途徑的有力工具。
dCas9-SAM系統(tǒng)是一種，在不改變內(nèi)源基因組的條件下，可以選擇性地上調(diào)特定靶基因表達(dá)的簡便方法。由于其強(qiáng)大的激活能力，該系統(tǒng)將成為跨越多種細(xì)胞類型的治療性干預(yù)、基因篩選工具。研究人員已經(jīng)開始利用dCas9-SAM系統(tǒng)激活HIV-1轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)休HIV-1前病毒休眠。
Figure 2 ： The dCas9-SAM transcriptional activation system. a) The dCas9-SAM system is made up of a dCas9 fused to the transcriptional activator, VP64. The accompanying sgRNA can also be modified to contain two RNA aptamers for binding with MS2 coat proteins that are also fused to one p65 and one HSF1 transcription activator. Adapted from Figure 1f of La Russa et al. (2015). b) A comparison of the activation efficiency of dCas9-VP64 by itself (yellow) as well as with the modified sgRNA system (green) in the activation of four different genes: HBG1, IL-1B, IL1R2, and ZFP42. Relative expression levels were quantified using qPCR, with fold changes determined by comparing with GFP-transfected cells. Adapted from Figure 1b of Konermann et al. (2015). c) The dCas9-VPR system is composed of an ordered fusion of transcriptional activators VP64, p16, and RTA. This system does not require a specially modified sgRNA to achieve the same activation capability as the dCas9-SAM system. Adapted from Figure 1a of Chavez et al. (2016). d) A comparison of the activation performance of dCas9-VP64, dCas9-VPR, and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene
單獨(dú)的dCas9與靶位點(diǎn)的結(jié)合在空間上可以干擾轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合，起到抑制靶向基因轉(zhuǎn)錄的作用，這一過程稱為CRISPRi（或CRISPR干擾）。這個(gè)簡單的CRISPRi系統(tǒng)可以高達(dá)1000倍抑制，有效敲低細(xì)胞中的基因表達(dá)。雖然這個(gè)系統(tǒng)在細(xì)菌、酵母和其他原核細(xì)胞中的表現(xiàn)相當(dāng)好，但它在抑制哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)方面效果較差。
因此我們開發(fā)了dCas9-KRAB系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，dCas9與Kox1的轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域KRAB（Krüppel-associated box）融合（圖3a）。這種增強(qiáng)的CRISPRi系統(tǒng)依靠KRAB募集各種各樣的組蛋白修飾因子，通過形成異染色質(zhì)的方式可逆地抑制基因表達(dá)。該系統(tǒng)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染期間可以高度特異性地使內(nèi)源性真核基因表達(dá)降低60-80％（圖3b）。此外，在HeLa細(xì)胞中，穩(wěn)定整合到基因啟動子區(qū)域的dCas9-KRAB可以使內(nèi)源性基因產(chǎn)生5-10倍的抑制作用，當(dāng)靶位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游50-100bp時(shí)可產(chǎn)生100倍的抑制效應(yīng)。 dCas9-KRAB對細(xì)胞生長沒有影響，使其成為無毒的基因沉默方法。
不同于其他經(jīng)典的基因沉默方法，如RNAi（一種通過降解細(xì)胞質(zhì)中mRNA來敲低基因表達(dá)的方法），dCas9-KRAB系統(tǒng)在DNA水平上提供可抑制。這使得高度特異性抑制非編碼RNA，miRNA，反義轉(zhuǎn)錄物和核定位的RNA成為可能。
Figure 3 ：The dCas9-KRAB transcriptional repression system. a) dCas9 can be fused to KRAB, a transcriptional repressor. Adapted from Shalem et al. (2015). b) A comparison of relative CD71 expression levels in a dCas9 (blue) vs. a dCas9-KRAB (red) system targeted to CD71 using three different sgRNAs. Relative expression levels were determined from flow cytometry for CD71 protein expression. Adapted from Figure 3c of Gilbert et al. (2013).
