亚洲综合无码一级片无码的_国产丝袜一二三四区乱码_欧美福利大片二区_男人边吃奶边做边爱免费

高效、務(wù)實、嚴謹、敬業(yè)
熱點專題
技術(shù)服務(wù)
技術(shù)專題
聯(lián)系我們

聯(lián)系我們

廣州賽誠生物科技有限公司
廣州市黃埔區(qū)學大道攬月路廣州企業(yè)孵化器B座402
電話:020-85625352
手機:18102256923、18102253682
Email:servers@gzscbio.com
Fax:020-85625352
QQ:386244141
Cas9-敲入系統(tǒng)

CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)(knock in

?實驗原理

    CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)是Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA,且有一段高度同源的DNA修復模板存在的情況下,生物體內(nèi)啟動HDR修復路徑,將一段外源DNA定點插入基因內(nèi)部。

   同源性定向修復(HDR)途徑,對比NHEJ修復途徑,同源性定向修(HDR)途徑是更為精確的修復機制。 這種修復機制主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導的基因敲入。 在該修復路徑中,需要將一段與預期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNACas9核酸酶一起引入細胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情況下, HDR機制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點(圖4)。這種修復方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點。

3.1.5CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)①.png

1基因敲入原理圖


?實驗流程

    1 .設(shè)計sgRNA-Cas9及修復DNA模版

    2 .構(gòu)建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒

    3 .sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉(zhuǎn)293T細胞

    4 .嘌呤篩選,檢測熒光

    5 .PCR檢測基因組,RFP蛋白是否敲入


?實驗步驟

    1. 設(shè)計sgRNA及修復DNA模版

針對人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設(shè)計了sgRNA進行軟件分析以確保sgRNA沒有預測的脫靶結(jié)合位點。設(shè)計DNA修復模版,兩側(cè)同源臂,其兩側(cè)各有600bp的同源臂。

    

    2 .構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒

將選定的sgRNA設(shè)計與CMV啟動子驅(qū)動的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1(圖2)。

DNA修復模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達載體(圖2)。

3.1.5CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)②.png

 2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模版質(zhì)粒

   

    3 .sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉(zhuǎn)293T細胞

    用lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞。

 

    4. 嘌呤篩選,檢測熒光

    嘌呤篩選3-4

      3-4周后,> 95%的HEK293細胞表達RFP(圖3)。

3.1.5CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)③.png

3 熒光檢測圖片  A轉(zhuǎn)染篩選后明場圖片   B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細胞

   

     5. PCR檢測基因組,RFP蛋白是否敲入

    為了證實在基因組DNA中敲入RFP,設(shè)計引物對,引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內(nèi)的引物2。

1.1kbPCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點敲入成功; 沒有PCR擴增指示敲入不成功(圖4)。

3.1.5CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)④.png

4  PCR產(chǎn)物檢測,在對照細胞('WT細胞')中沒有看到PCR擴增。



目錄瀏覽