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CRISPR-Cas9-基因敲除系統(tǒng)（knock out）
實(shí)驗(yàn)原理：
CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)是Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，生物體啟動(dòng)NHEJ修復(fù)途徑，切割位點(diǎn)產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致基因沉默。
NHEJ修復(fù)途徑是一種錯(cuò)誤傾向修復(fù)機(jī)制，用于在缺少修復(fù)模板的情況下修復(fù)斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因沉默。主要用于當(dāng)DNA發(fā)生斷裂時(shí)，NHEJ修復(fù)途徑被開(kāi)啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個(gè)堿基，然后雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個(gè)過(guò)程極容易導(dǎo)致切割位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，從而沉默該基因（圖3）。因此，在沉默編碼基因時(shí)， gRNA應(yīng)靶向基因的N端來(lái)確保最大程度的基因破壞。
實(shí)驗(yàn)流程：
1.設(shè)計(jì)sgRNA
2.構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
3.構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
4 .篩細(xì)胞克隆并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證
5 .陽(yáng)性克隆測(cè)序，選擇敲除純合細(xì)胞株
6 .篩選細(xì)胞單克隆測(cè)序
實(shí)驗(yàn)步驟：
? 1、設(shè)計(jì)sgRNA
針對(duì)小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設(shè)計(jì)了三種sgRNA。 進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預(yù)測(cè)的脫靶結(jié)合位點(diǎn)。
? 2、構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
然后將選擇的sgRNA設(shè)計(jì)克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。
圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜
? 3、構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
利用慢病毒包裝體系構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株，進(jìn)行嘌呤篩選
? 4、 篩細(xì)胞克隆并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證
嘌呤霉素篩選后分離細(xì)胞克隆。 提取基因組DNA并進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)定目的基因座是否進(jìn)行編輯.
圖2 qPCR檢測(cè)基因組編輯情況。在野生型（WT）測(cè)定中的單個(gè)條帶表示沒(méi)有發(fā)生編輯; 兩個(gè)較小的條帶（總和WT的長(zhǎng)度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒(méi)有編輯; 克隆1是不確定的。
?5 、陽(yáng)性克隆測(cè)序，選擇突變細(xì)胞株
通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)一步分析細(xì)胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。
圖3 細(xì)胞基因組測(cè)序結(jié)果。對(duì)于細(xì)胞集落3，只檢測(cè)到一個(gè)突變序列，表明這些細(xì)胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測(cè)到兩種不同的突變序列。
? 6 、篩選細(xì)胞選擇單克隆純合突變細(xì)胞株
將菌落6連續(xù)稀釋到96孔板中進(jìn)行單克隆選擇。 從這些克?。?/span>6a，6b ..）中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆和測(cè)序。
圖4細(xì)胞基因組測(cè)序結(jié)果。測(cè)序顯示，在兩個(gè)等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開(kāi)放閱讀框架，導(dǎo)致無(wú)意義介導(dǎo)的mRNA。
? 7.進(jìn)一步測(cè)序，確定純合突變
圖5 細(xì)胞基因組測(cè)序結(jié)果
