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不同的CRISPR系統(tǒng)
一、CRISPR-Cas9 突變體系統(tǒng)
Cas9核酸酶共有兩種突變體：Cas9 Nickase（單突變）和dCas9（雙突變）。
?Cas9 Nickase
CRISPR Cas9技術(shù)的潛在脫靶效應(yīng)可能是由Cas9核酸酶活性引起的。 為了改善由Cas9核酸酶活性引發(fā)的脫靶效應(yīng)，開發(fā)了Cas9 Nickase。 Cas9 Nickase是Cas9的突變形式， 是由RuvC1和 HNH兩個核酸酶活性區(qū)域中其中一個核酸酶活性區(qū)域突變而成。 這種突變形式產(chǎn)生單鏈缺口而不是在靶位點的雙鏈斷裂。（圖6）
利用Cas9 Nickase進行基因組編輯，需要兩個gRNA而不是一個。 兩個gRNA將被設(shè)計在相反的DNA鏈上且緊密接近（序列相距不超過20bp），以確保一旦兩條鏈被Cas9 Nickase切割時，就會產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。 這種配對的Cas9 Nickase減少了脫靶效應(yīng)，因為兩個gRNA需要一起作用才能產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂（圖7）。一旦雙鏈DNA斷裂，NHEJ或HDR路徑將被激活以完成基因組編輯過程。
Figure 6 ：The Cas9 nickase is a mutant form of the Cas9 nuclease where one of its cleavage domains has been disabled. Using Cas9 Nickase, off-target effects of the wild type Cas9 can be minimize, since the nicks in the DNA rarely lead to InDel mutations.
Figure 7 ： When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.
?dCas9
dCas9的英文為dead Cas9，即Cas9的RuvC1和 HNH兩個核酸酶活性區(qū)域同時發(fā)生突變。因此，dCas9只保留由gRNA引導(dǎo)進入基因組的能力，剪切酶活性全部消失。dCas9主要是與其他效應(yīng)蛋白融合（如GFP、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾等），進行基因調(diào)控，基因組成像，染色質(zhì)或DNA修飾以及染色質(zhì)免疫沉淀等。
Figure 8 ：The Cas9 null mutant has lost both of its DNA cleavage domains while still retaining its ability to target genomic loci through gRNA:DNA interactions. By fusing effector domains to the Cas9 null mutant, it is possible to activate gene expression (i.e. V964 or NF-kB), repress gene expression (i.e. KRBA domain), visualize genomic loci (i.e. EGFP), perform chromatin remodelling (i.e. TET proteins), and simplify chromatin immunopercipitation (through an antibody epitope tag)
二、其他的CRISPR系統(tǒng)-saCas9 and Cpf1 核酸酶
為了解決spCas9的局限性，即其大尺寸和富含G的PAM序列，已經(jīng)研究出幾種 CRISPR酶作為潛在替代物，最顯著的是Cpf1和saCas9。表3總結(jié)了spCas9，saCas9和Cpf1之間的一些重要差異和相似之處。
Table 3: Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases
| spCas9 | saCas9 | Cpf1 | |
| Gene Length | ~4.1 kb | ~3.3 kb | ~3.8 kb |
| Cleavage Type | Blunt ends | Blunt ends | 5' overhangs |
| Repeated Cleavage | No | No | Yes |
| Cleavage Site | Within recognition sequence | Within recognition sequence | Downstream of recognition sequence |
| PAM Sequence | 5’-NGG-3’ | 5’-NNGRRT-3’ | 5’-TTN-3’ or 5’-TTTN-3’ |
| RNA Required | tracrRNA + crRNA | tracrRNA + crRNA | crRNA |
?Cpf1核酸酶
2015年末，麻省理工學(xué)院的張峰小組發(fā)現(xiàn)了一種新的CRISPR核酸酶Cpf1。Cpf1可以識別富含T的PAM基礎(chǔ)，與富含G的PAM -Cas9相比，這顯著擴大了基因組靶標(biāo)的廣度。因此，Cas9是富含G的基因組區(qū)域的首選核酸酶，而 Cpf1主要用于靶向富含T的基因組
與Cas9相比，Cpf1的gRNA更短一些， Cas9的gRNA是約100nt的tracrRNA / crRNA雜合體，而Cpf1的gRNA是僅有42nt的 crRNA。這將gRNA的大小減少了一半以上，同時也簡化了與合成和化學(xué)修飾相關(guān)的方法和節(jié)約了成本，也使得Cpf1成為復(fù)合基因組編輯的最佳選擇，即可將多個gRNA插入同一載體并進行同步基因編輯。
Cpf1切割位于PAM位點下游18-23bp的DNA， NHEJ修復(fù)斷裂的雙鏈DNA后識別序列不中斷。因此，Cpf1能夠進行多輪DNA切割，增加了產(chǎn)生基因組編輯的機會。相比之下， Cas9在PAM位點上游3bp切割，NHEJ修復(fù)雙鏈DNA后識別序列會被破壞。
?saCas9核酸酶
saCas9從金黃色葡萄球菌中分離的微型Cas9核酸酶。
SaCas9比spCas9小約1kb，這使其能夠更有效地包裝進較小容量的腺病毒（AAV）中，為調(diào)節(jié)元件，crRNA和tracrRNA留下額外的空間。也使得將Cas9與gRNA構(gòu)建到一個載體上成為可能，稱為All-In-One載體。
spCas9識別5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9識別5'-NNGRRT-3'。PAM序列的更多變意味著可用于基因組編輯的基因座數(shù)目增加。當(dāng)需要使用同源性定向修復(fù)的基因的精確編輯時，這是特別有益的，因為當(dāng)識別序列非常接近待編輯區(qū)域時HDR是最有效的。saCas9更長的PAM的一個缺點是，這個序列在基因組中比spCas9的PAM序列發(fā)生基因編輯的可能性小，限制了它的潛在效用。但是，saCas9較長的PAM序列增加了識別的特異性，有助于防止脫靶效應(yīng)
