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Cas9基因敲入(knock in)
圖1基因敲入原理圖
-、概要
1. 設(shè)計(jì)sgRNA-Cas9及修復(fù)DNA模版
2 .構(gòu)建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復(fù)DNA模板質(zhì)粒
3 .將sgRNA-Cas9、修復(fù)DNA模版共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞
4. 嘌呤篩選，檢測(cè)熒光
5 .PCR檢測(cè)基因組，RFP蛋白是否敲入
針對(duì)人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設(shè)計(jì)了sgRNA進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒有預(yù)測(cè)的脫靶結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)DNA修復(fù)模版，兩側(cè)同源臂，其兩側(cè)各有600bp的同源臂。
將選定的sgRNA設(shè)計(jì)與CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1（圖2）
將DNA修復(fù)模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達(dá)載體（圖2）。
圖2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復(fù)DNA模版質(zhì)粒
用lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。
4. 嘌呤篩選，檢測(cè)熒光
嘌呤篩選3-4周
3-4周后，> 95％的HEK293細(xì)胞表達(dá)RFP（圖3）。
圖3 熒光檢測(cè)圖片 A轉(zhuǎn)染篩選后明場(chǎng)圖片 B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細(xì)胞
為了證實(shí)在基因組DNA中敲入RFP，設(shè)計(jì)引物對(duì)，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內(nèi)的引物2。
1.1kb的PCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點(diǎn)敲入成功; 沒有PCR擴(kuò)增指示敲入不成功（圖4）。
在對(duì)照細(xì)胞（'WT細(xì)胞'）中沒有看到PCR擴(kuò)增。
