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Cas9敲除基因(knock out)
【概要】
1.設(shè)計sgRNA
2.構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
3.構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
4 .篩細胞克隆并進行qPCR驗證
5 .陽性克隆測序，選擇敲除純合細胞株
6 .篩選細胞單克隆測序
【實驗技術(shù)】
?1.設(shè)計sgRNA
針對小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設(shè)計了三種sgRNA。 進行軟件分析以確保sgRNA沒有預測的脫靶結(jié)合位點。
?2.構(gòu)建sgRNA-Cas9載體
然后將選擇的sgRNA設(shè)計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。
圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜
?3.構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株
利用慢病毒包裝體系構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株，進行嘌呤篩選
?4. 篩細胞克隆并進行qPCR驗證
嘌呤霉素篩選后分離細胞克隆。 提取基因組DNA并進行驗證測定目的基因座是否進行編輯
圖2 qPCR檢測基因組編輯情況
在野生型（WT）測定中的單個條帶表示沒有發(fā)生編輯; 兩個較小的條帶（總和WT的長度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒有編輯; 克隆1是不確定的。
?5 .陽性克隆測序，選擇突變細胞株
通過Sanger測序進一步分析細胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。
圖3 細胞基因組測序結(jié)果
對于細胞集落3，只檢測到一個突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。
?6. 篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株
將菌落6連續(xù)稀釋到96孔板中進行單克隆選擇。 從這些克隆（即6a，6b ..）中提取基因組DNA，進行PCR擴增，克隆和測序。
圖4 細胞基因測序結(jié)果
測序顯示，在兩個等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開放閱讀框架，導致無意義介導的mRNA。
?7、進一步測序，確定純合突變
圖5 細胞基因組測序結(jié)果
