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FISH 免疫熒光原位雜交技術(shù)
免疫熒光原位雜交是在組織、細(xì)胞等水平上對(duì)蛋白、DNA或RNA進(jìn)行定性、定位和定量分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
1、RNA FISH
用已知的熒光標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生熒光來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核酸。
在RNA-FISH實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們?cè)O(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效，如探針模板DNA片段PCR擴(kuò)增跑膠圖、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物跑膠圖。具體示例如下圖所示：
探針跑膠圖，泳道一為探針體外轉(zhuǎn)錄模板DNA，泳道二為體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針。
RNA-FISH結(jié)果示例：
上圖為RNA-FISH結(jié)果示例，是對(duì)細(xì)胞內(nèi)LncRNA BCAR4的定位，以actin mRNA作為內(nèi)參，以SCR作為陰性對(duì)照。從圖可看出LncRNA BCAR4位于細(xì)胞核內(nèi)。
2、蛋白FISH
用目的蛋白抗體與細(xì)胞進(jìn)行孵育，然后用帶熒光標(biāo)記的二抗孵育檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)和定位。
蛋白FISH示例：
上圖為蛋白FISH結(jié)果的一個(gè)示例，檢測(cè)的是LncRNA正常表達(dá)細(xì)胞和過(guò)量表達(dá)細(xì)胞中的Vimentin蛋白，E1和E2組是LncRNA正常表達(dá)的細(xì)胞，OC1和OC2是LncRNA過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞。從上圖可清晰的看到LncRNA過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞Vimentin蛋白明顯高于正常表達(dá)的細(xì)胞。
3、RNA-蛋白FISH
用已知的熒光標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸，然后用目的蛋白抗體與細(xì)胞進(jìn)行孵育，用帶熒光標(biāo)記的二抗孵育檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白的表達(dá)和互作定位。
在RNA-蛋白FISH實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們?cè)O(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效，如DNA片段PCR擴(kuò)增跑膠圖、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物跑膠圖。具體示例如下圖所示：
探針跑膠圖，泳道一為探針體外轉(zhuǎn)錄模板DNA，泳道二為體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針。
RNA-蛋白FISH示例：
上圖為RNA-蛋白FISH結(jié)果的一個(gè)示例，檢測(cè)的是LncRNA OLA1P2與磷酸化了的轉(zhuǎn)錄因子STAT3的關(guān)系，從上圖可看出兩者均位于細(xì)胞質(zhì)中并且出現(xiàn)的位置重合，說(shuō)明兩者之間有互作關(guān)系。