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DNA/RNA EMSA 凝膠電泳遷移實驗
凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一種研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù),可用于研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用、DNA/RNA定性和定量分析。生物素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。
如上圖所示,DNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢;當(dāng)檢測DNA結(jié)合蛋白,可用純化蛋白、部分純化蛋白或核細胞抽提液;競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA片段和寡核苷酸片段(特異)和其它非相關(guān)的片段(非特異),來確定DNA結(jié)合蛋白的特異性;在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。
在EMSA實驗過程中我們設(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實驗的真實有效,如DNA片段PCR擴增跑膠圖、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物跑膠圖。具體示例如下圖所示(DNA EMSA):
EMSA探針跑膠檢測:
EMSA結(jié)果為凝膠電泳遷移圖,示例如下圖所示:
組別1為陰性對照;組別2中生物素標(biāo)記的檢測基因(LXRE2)與蛋白結(jié)合,出現(xiàn)條帶遷移;組別3中沒有標(biāo)記的基因(LXRE)競爭性與蛋白結(jié)合,LXRE2條帶不遷移;組別4中對LXRE進行突變,LXRE2條帶重新發(fā)生遷移。從實驗結(jié)果可以明確LXRE2為與調(diào)控蛋白特異結(jié)合的位點。