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Luciferase 熒光素酶實驗
啟動子熒光素酶活性檢測
螢光素酶報告基因?qū)嶒灒?/span>luciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，其原理簡述如下：（1）用靶啟動子的特定片段替換報告基因質(zhì)粒（如pGL3-basic）的啟動子區(qū)。（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。如果該轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則螢光素酶就會表達，且其表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。（3） 加入特定的底物，螢光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生螢光素，檢測熒光的強度可以對螢光素酶的活性定量，進而判斷該轉(zhuǎn)錄因子能否與靶啟動子片段發(fā)生作用 （及其作用強度）。
Promoter活性Luciferase實驗常用載體——pGL3
3’-UTR活性檢測
由于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報告基因luciferase的后面， 通過比較過表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結(jié)合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。
miRNA靶基因Luciferase實驗常用載體——psiCHECK2
PCR擴增Luciferase點突變靶基因
在熒光素酶活性實驗過程中我們設(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實驗的真實有效，如目的基因啟動子片段擴增跑膠圖、重組質(zhì)粒PCR驗證跑膠圖、測序，最后結(jié)果分析。具體示例如下圖所示（以啟動子熒光素酶為例）：
目的基因啟動子片段的PCR擴增
重組質(zhì)粒PCR驗證，證明目的基因片段插入到報告質(zhì)粒載體上。
啟動子熒光素酶活性檢測結(jié)果示例，本實驗檢測的是轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子的關(guān)系，從上圖結(jié)果我們可以看出轉(zhuǎn)錄因子對目的基因的啟動子起作用促進基因的表達，而目的基因啟動子片段突變后基因的表達就不受轉(zhuǎn)錄因子的影響。