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>>基因表達(dá)調(diào)控
>>基因表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)技術(shù)
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RNA pull-down
RNA pull-down
RNA pull-down是檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。RNA pull-down使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。
在RNA pull-down實(shí)驗(yàn)過程中我們設(shè)置一系列的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以確保每一步實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效，如RNA探針模板PCR擴(kuò)增跑膠檢測、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物跑膠檢測、產(chǎn)物銀染圖。具體示例如下圖所示：
RNA探針體外轉(zhuǎn)錄后消化DNA模板，然后跑膠檢測RNA探針質(zhì)量。
RNA pull-down產(chǎn)物通過跑膠銀染檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組是否含有差異條帶，以確保結(jié)果的可靠性。
RNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般為產(chǎn)物的WB驗(yàn)證或MS分析數(shù)據(jù)，如圖為RNA pull-down產(chǎn)物的WB結(jié)果示例。
以反義鏈RNA探針為陰性對照，結(jié)果表明目的RNA與蛋白能夠特異性的結(jié)合。
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