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CHIRP 免疫共沉淀實驗
CHIRP(Chromatin Isolation by RNA Purification)是一種檢測體內(nèi)與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法，可同時分析lncRNA/circRNA 、蛋白及DNA三者互作關(guān)系。利用ChIRP-seq技術(shù)可用于在全基因范圍內(nèi)定位lncRNA/circRNA的結(jié)合位點和可能結(jié)合的其他RNA分子,是揭示位于細(xì)胞核內(nèi)lncRNA/circRNA 生物學(xué)機(jī)制的關(guān)鍵實驗手段。該方法是通過設(shè)計與目標(biāo)RNA序列反向互補(bǔ)的生物素探針，把目標(biāo)RNA拉下來以后，與其共同作用的DNA染色體片段就會附到鏈霉親和素磁珠上，最后通過qRT-PCR或測序來測定目的RNA、DNA序列，亦或是通過Western或質(zhì)譜分析來測定蛋白
技術(shù)優(yōu)勢：
（1）、CHIRP實驗可研究細(xì)胞體內(nèi)互作；
（2）、CHIRP實驗既同時可研究RNA、蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合體之間的互作；也可研究它們之間的兩兩互作；
（3）、利用CHIRP-MS實驗尋找與目的lncRNA結(jié)合的蛋白，可不受lncRNA長度的限制；
（4）、利用CHIRP實驗可研究circRNA與蛋白質(zhì)或DNA之間的互作。
技術(shù)流程：
（1）、CHIRP-RNA：探針設(shè)計與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→RNA回收與純化→NGS或qRT-PCR檢測；
（2）、CHIRP-DNA：探針設(shè)計與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→DNA回收與純化→NGS或qPCR檢測；
（3）、CHIRP-Protein：探針設(shè)計與合成→細(xì)胞交聯(lián)→細(xì)胞裂解、超聲處理→探針雜交→復(fù)合物純化→蛋白分離→質(zhì)譜鑒定。
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ChIRP實驗標(biāo)準(zhǔn)實驗分組如下：
（1）、IP組：目標(biāo)lncRNA/circRNA Odd組和Even組（即實驗組，用于鑒定lncRNA/circRNA作用基因組位置）
（2）、lacZ組：外參對照組，證明ChIRP探針的特異性；
（3）、Input組：捕獲前分離提取的基因組DNA，作為內(nèi)參對照組，證明探針特異性；
（4）、Positive組：陽性對照組，通過已知驗證有效的探針，通過WB檢測已知結(jié)合蛋白質(zhì)，證明整個ChIRP實驗體系的有效性；
（5）、目標(biāo)lncRNA/circRNA qPCR：證明ChIRP探針對目標(biāo)lncRNA的正確結(jié)合及有效捕獲。
案例分析：
案列1：ChRIP-protein研究
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結(jié)果解析：圖A展示的整個ChIRP-WB或ChIRP-MS實驗大致的實驗流程；圖B闡述的是ChIRP實驗中U1探針和U2探針富集到的RNA長度分布，結(jié)果顯示，input組的RNA大小為150-4000nt不等，而U1探針和U2探針富集的RNA長度為150-200nt，說明U1探針和U2探針能有效地富集樣本中的U1和U2；圖C是U1、U2、U3的ChIRP-WB實驗結(jié)果，實驗結(jié)果證明，U1和U2可與U1A蛋白結(jié)合，U3可與FIBRILLARIN蛋白結(jié)合。
參考文獻(xiàn)：Systematic discovery of Xist RNA binding proteins，figuer1.
案列2：ChRIP-DNA研究
結(jié)果解析：圖A展示的是通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測出lncRNA FOXD2-AS1與TRIB3 Promoter的三個結(jié)合位點；圖B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3細(xì)胞中進(jìn)行ChIRP-qPCR實驗結(jié)果；圖C是ChIRP實驗中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1的奇數(shù)探針和偶素探針的富集效率檢測結(jié)果。綜合實驗結(jié)果表明，lncRNA FOXD2-AS1可與TRIB3 Promoter結(jié)合，且結(jié)合位點位于預(yù)測位點的P3位點。
參考文獻(xiàn)：The long non-coding RNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through a positive feedback loop with Akt and E2F1，figuer6.
案列3：ChRIP-circRNA-protein研究
結(jié)果解析：圖a展示的是圖b、c、d實驗的簡單實驗流程圖；圖b是利用circRNA探針進(jìn)行的類似ChIRP實驗原理的RNA pulldown結(jié)果；圖c是對圖a的circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行qPCR的實驗結(jié)果；圖d是利用circRNA探針進(jìn)行ChIRP-qPCR實驗結(jié)果。綜合實驗結(jié)果表明，circEIF3J和circPAIP2能與RNA聚合酶復(fù)合體結(jié)合，也能與本身目基因啟動子結(jié)合從而調(diào)控母基因的表達(dá)水平。
參考文獻(xiàn)：Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus，figuer5.
案列4：ChRIP-circRNA-miR研究
結(jié)果解析：圖A展示的是circPVT1與microRNA結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果；圖B是類似ChIRP實驗原理的circRNA pulldown原理圖；圖C是對circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行circPVT1的qPCR的實驗結(jié)果，該結(jié)果反映的是circPVT1探針的有效性；圖D是circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行microRNA qPCR檢測的實驗結(jié)果。綜合實驗結(jié)果表明，circPVT1能與has-let-7有效結(jié)合，從而達(dá)到富集細(xì)胞內(nèi)的游離的has-let-7，進(jìn)而間接調(diào)控has-let-7的下游靶基因。
參考文獻(xiàn)：Identification of senescence-associated circular RNAs(SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1，figuer4.
樣本要求：
細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞數(shù)量需要達(dá)到108個；提供活細(xì)胞樣本。
實驗周期：
50個工作日。
公司提供：
實驗報告（材料、試劑、儀器、方法、數(shù)據(jù)分析、實驗結(jié)果）。
其他注意事項：
1、目標(biāo)lncRNA/circRNA的表達(dá)豐度：
2、如果目標(biāo)lncRNA/circRNA表達(dá)豐度較低，需要進(jìn)行過表達(dá)以確保ChIRP成功；