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miRNA的生物發(fā)生

      目前，動物miRNA的生物合成、加工、運輸和作用原理已經(jīng)初步闡明。

miRNA產(chǎn)生過程模式.png

圖1  miRNA產(chǎn)生過程模式

 

圖1為miRNA生產(chǎn)過程的示意圖。首先，在RNA聚合酶作用下細胞核中編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄生成長度約為幾千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA。Pri-miRNA在5’端具有甲基化的鳥嘌呤，而3’端具有多聚腺嘌呤堿基，同時具有一個或幾個局部的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，以多順反子形式存在。并且，α-amanitin 可以抑制這一轉(zhuǎn)錄過程。有一部分miRNA的轉(zhuǎn)錄是由RNA 聚合酶II所完成的。Pri-miRNA的進一步加工主要在micro processor的蛋白復(fù)合體完成。這個大小約為 400-500 kDa大小的復(fù)合體主要由Drosha和Pasha兩個蛋白組成。其中Drosha為一種 RNase III蛋白，而Pasha則是一個雙鏈RNA結(jié)合蛋白（double-stranded RNA binding protein），參與 Drosha 對底物的識別。Pri-miRNA在Drosha的作用下，進一步被加工成含有60-70 nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體（pre-miRNA）。Pre-miRNA在RanGTP/Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer識別，并通過對莖環(huán)結(jié)構(gòu)的剪切和修飾，在細胞質(zhì)內(nèi)形成 miRNA:miRNA*二聚體。miRNA:miRNA*二聚體在解旋酶作用下，最終生成成熟的、具有功能單鏈 miRNA，并隨之和miRNP（miRNA ribonucleo proteins）復(fù)合體結(jié)合，而miRNA*則被迅速降解。

 

1 miRNA的生物合成

細胞中miRNA的合成.png

圖2 細胞中miRNA的合成

 

Drosha與其他分子一起形成“微處理器復(fù)合體（microprocesssor complex）”，從而發(fā)揮分子尺的作用，判斷pri-miRNA中的切割位點。在這個復(fù)合體中，Drosha與其輔酶因子DGCR8或Pasha（選擇主要取決于物種）相互作用。與Drosha一樣，DGCR8或Pasha同樣能夠在dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dsRBD）的作用下與sdRNA相結(jié)合。一個典型的多細胞動物的pri-miRNA包含一個33bp長的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、一個末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)及一個ssRNA側(cè)翼片段（flanking segment）。這個側(cè)翼片段對于pri-miRNA與DGCR8因子的結(jié)合非常重要，而33bp長的莖環(huán)結(jié)構(gòu)對于它們的有效結(jié)合同樣意義重大。Drosha蛋白可以利用微處理器復(fù)合體這種“切割前”復(fù)合體短暫地與dsRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)相互作用，而蛋白的酶切作用中心位點位于ssRNA與dsRNA交界處長11bp的一段序列中，在該位點切開之后會形成交錯配對的切口，生成長約65-70bp的pre-miRNA。這種情況下，DGCR8蛋白可以發(fā)揮分子尺的作用，“測量”ssRNA與dsRNA交界處的長短。微處理器復(fù)合體很有可能通過識別ssRNA末端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)找到RNA，然后在另一端與其莖環(huán)結(jié)構(gòu)相結(jié)合。在這種情況下，可能會在一段靠近RNA末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長約11bp的可變區(qū)域里發(fā)生不完全剪切。不過，絕大部分的pri-miRNA分子內(nèi)部都含有突出結(jié)構(gòu)，或者配對不十分匹配的區(qū)域，而這段區(qū)域也都是位于離末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)大約11bp處，因此這就能夠避免在該處發(fā)生錯誤切割的問題。

最近發(fā)現(xiàn)，有很多編碼這種miRNA的基因都位于內(nèi)含子區(qū)域，對這類miRNA的處理是不需要Drosha酶參與的，而是直接通過剪接體（spliceosome）來完成。這些內(nèi)含子miRNA（也被稱作mirtron）3’端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和一個細小的、已注釋的內(nèi)含子3’端的剪接位點的剪切機制與核內(nèi)pre-mRNA的間接機制相同，所以無需Drosha酶的參與。接下來，以套索形式被剪接體釋放出來的mirtron前體分子會在去分支酶（debranching enzyme）的作用下線性化。隨后，它們模擬pre-miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)直接進入miRNA處理程序，繼而被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)被Dicer酶處理，而不是被Drosha酶剪切。

由于Dicer酶和Drosha酶缺乏剪切精確性，因此可能會生成一系列5’端和3’端各異的miRNA-miRNA*雙鏈產(chǎn)物。在動物細胞中，大部分miRNA都會與目的mRNA形成配對不十分精確的雜交雙鏈。這種配對的精確性絕大部分都是由miRNA分子的5’端的第2-8位序列來提供的，這段序列也被稱做種子區(qū)域。Dicer酶和Drosha酶不精確的剪切既有可能改變種子區(qū)域，也有可能顛覆雙鏈分子5’端和3’端的相對穩(wěn)定性。不過，最近一系列針對miRNA開展的深度測序研究結(jié)果顯示，人體細胞可能剛好利用了這種剪切的不精確性，因為這樣可以利用同一前體RNA分子獲得大量不同的miRNA產(chǎn)物，從而大大擴展了miRNA分子的調(diào)控對象和途徑。

 

2 RISC復(fù)合體的結(jié)合、裝載過程

由dsRNA前體分子生成的miRNA在結(jié)合、裝載到RISC復(fù)合體時會從雙鏈狀態(tài)解離成單鏈狀態(tài)。這其中的關(guān)鍵步驟就是小dsRNA的解鏈過程和向?qū)ф湵贿x擇的過程。普遍認為，RISC裝載過程實際上就是一個熱力學問題。由于小dsRNA分子的熱力學不對稱（thermodynamic asymmetry）特性，是的其中一條鏈被選擇，另一條鏈被“拋棄”、降解。也就是說，小dsRNA分子中哪一條鏈的5’端如果在熱力學上顯得更不穩(wěn)定，那么他就是更有可能被RISC復(fù)合體“挑中”成為導(dǎo)向鏈，這也就是所謂的不對稱原理（asymmetry rule）。

在人體細胞中，pre-miRNA會與AGO2蛋白、DICER1蛋白和TRBP蛋白組成的三聚體相結(jié)合。這個復(fù)合體可以利用pre-miRNA降解目的RNA，也能在缺乏ATP水解作用的情況下區(qū)分miRNA和miRNA*。這說明在這個三聚體當中，是DICER1蛋白來切割并感知RNA分子的熱力學穩(wěn)定性情況的。

這個RISC復(fù)合體聚合的過程也能以一種不依賴酶切作用的途徑來完成。在人體細胞內(nèi)，四種Argonaute蛋白中有三種（AGO1、AGO3、AGO4）都缺乏酶切活性，但它們?nèi)匀荒軌蚺c向?qū)ф溄Y(jié)合。盡管我們最開始認為的在未解鏈pre-miRNA雙鏈分子中，由于存在錯配情況，會遮蔽隨從鏈的酶切位點，但我們?nèi)栽谌梭w細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)單鏈miRNA能夠與AGO2蛋白相結(jié)合。因此，在人體細胞內(nèi)肯定還存在一條不依賴酶切作用的旁路途徑來幫助RISC復(fù)合體的組成。在這條旁路途徑中，已發(fā)現(xiàn)RNA解旋酶A可能會參與其中，發(fā)揮RNA解鏈作用。

 

3 miRNA的分選過程

RISC復(fù)合體一旦組成，就會繼續(xù)完成RNA沉默機制里后續(xù)的一系列反應(yīng)，包括抑制mRNA翻譯，維持基因組穩(wěn)定性等等。RISC復(fù)合體的這些特異性功能都與Argonaute蛋白相結(jié)合的特殊蛋白有關(guān)。換句話說，那就是不同的RISC復(fù)合體可根據(jù)組成它的Argonaute蛋白來區(qū)分。

在黑腹果蠅中，pre-miRNA是有DCR-1蛋白生成的。其后就依其自身結(jié)構(gòu)與AGO1或AGO2蛋白相結(jié)合。如果小dsRNA分子中又不配對序列存在、中部形成突出結(jié)構(gòu)（多見于miRNA前體分子中），那么它就會與AGO1蛋白結(jié)合。如果小dsRNA之間配對情況良好，那么它就會與AGO2蛋白相結(jié)合。這是因為DCR-2-R2D2異源二聚體可以招募AGO2蛋白形成RISC復(fù)合體前體，這種復(fù)合體可以很好地結(jié)合配對良好的小dsRNA分子，但是不能與上述配對不佳的小dsRNA分子結(jié)合。

不過，雖然AGO1蛋白比較傾向于結(jié)合序列中部分有錯配情況的小RNA分子，但是大部分沒有錯配情況的miRNA-miRNA*雙鏈分子同樣能夠與含有AGO1蛋白的RISC復(fù)合體結(jié)合，這說明AGO1結(jié)合途徑是有選擇性的，它不會毫無保留地完全接受被AGO2蛋白“篩掉”的小RNA分子。



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