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圖1 生物信息學(xué)在miRNA研究中的應(yīng)用
當(dāng)開(kāi)始研究一基因是否為一個(gè)miRNA調(diào)控的靶基因時(shí)，可以用不同的生物信息學(xué)計(jì)算方法來(lái)分析每個(gè)序列（如mRNA的3'-UTR區(qū)序列），這些計(jì)算方法采用不同的參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)一個(gè)給定的靶mRNA內(nèi)具功能性miRNA結(jié)合位點(diǎn)的可能性。由于每種 計(jì)算方法的有效性不同，下面3種計(jì)算方法應(yīng)該被用來(lái)預(yù)測(cè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)： miRanda、TargetScan和PicTar.這3種計(jì)算方法都允許研究者輸入一個(gè)基因符號(hào)，這些計(jì)算方法將計(jì)算此基因內(nèi)所有預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。此外，這些計(jì)算方法可測(cè)定一個(gè)給定的miRNA所有的靶mRNA.因?yàn)椴煌挠?jì)算方法會(huì)預(yù)測(cè)出不同的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，所以同時(shí)使用多種計(jì)算方法進(jìn)行預(yù)測(cè)非常必要。值得注意的是，盡管miRNA結(jié)合位點(diǎn)在不同物種間的保守性是各種不同計(jì)算方法的組成部分，但并不是一個(gè)功能性位點(diǎn)所必需的。由于不同計(jì)算方法預(yù)測(cè)的結(jié)果存在很大的差異，如何確定哪些預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證成為研究者要面臨的一個(gè)難題。作者認(rèn)為至少這3種計(jì)算方法中的2種計(jì)算方法均預(yù)測(cè)到的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，有必要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
因?yàn)楹芏嘟?jīng)種子序列匹配預(yù)測(cè)的miRNA靶經(jīng)體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)并不是真的miRNA靶，為了起始一步減少預(yù)測(cè)到的抑制一給定的靶mRNA表達(dá)的miRNA的數(shù)量，進(jìn)一步的程序分析是有必要的。結(jié)構(gòu)特征控制著miRNA/mRNA間的相互作用的觀點(diǎn)已被越來(lái)越多的人所接受。例如，一個(gè)RNA分子的大部分結(jié)構(gòu)是高度復(fù)雜性的，只有特定的單鏈區(qū)域允許miRNAs接近并與互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合。因此，復(fù)雜的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能阻止miRNA/mRNA的相互作用。最近有研究證實(shí)，絕大部分已證實(shí)的靶的一個(gè)共同特征是優(yōu)先與基于熱動(dòng)力學(xué)在RNA分子中容易接近且沒(méi)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的3’-UTR區(qū)中的位點(diǎn)。由于RNA可接近性可能是靶識(shí)別的一個(gè)關(guān)鍵特征，所以有必要采用mFold軟件測(cè)定預(yù)測(cè)到的miRNA結(jié)合位點(diǎn)5’端和3’端各70個(gè)核苷酸的自由能，當(dāng)其低于平均隨機(jī)自由能時(shí)提示此位點(diǎn)允許miRNA接近并結(jié)合[20].這些允許miRNA接近并結(jié)合起來(lái)的位點(diǎn)，有必要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
在不同物種中成熟miRNA均是從具有莖環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的前體加工而來(lái)，具有較大的序列同源性?？寺〉降膍iRNA序列通過(guò)檢索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)找到在基因組中的位置，在和周?chē)蚪M序列比較中發(fā)現(xiàn)他們同樣具有相似的前體結(jié)構(gòu)，多位于編碼基因間或內(nèi)含子反向重復(fù)區(qū)域。一些miRNA基因在進(jìn)化上具有高度保守性，此為生物信息學(xué)篩選的基礎(chǔ)。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理，并結(jié)合生物信息軟件在已測(cè)序基因組中進(jìn)行搜索比對(duì)，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過(guò)試驗(yàn)鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分步及數(shù)量。目前國(guó)際上較為普遍使用的兩個(gè)計(jì)算機(jī)分析工具是miRseeker和miRscan，前者已用于果蠅及昆蟲(chóng)基因組候選基因的系統(tǒng)分析，后者則用于線蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物候選基因的分析。這兩個(gè)工具已經(jīng)成功鑒定出了大量的miRNA基因并通過(guò)了實(shí)驗(yàn)證實(shí)。由于miRseeker和miRscan的高靈敏度，它們已用于人類(lèi)miRNA基因的尋找。由于該方法只能用于已完成基因組測(cè)序的物種，而那些未完成測(cè)序的物種就無(wú)能為力，而且由于miRNA前體長(zhǎng)度的可變性，故用計(jì)算機(jī)方法尋找新基因具有一定的遺漏性，所以目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將計(jì)算機(jī)分析與實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合使用，使得miRNA的發(fā)現(xiàn)量成幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。目前日益發(fā)展的微陣列技術(shù)也在篩選miRNA基因方面顯示了極大的潛力。
隨著疾病特異性的miRNAs不斷被鑒定，對(duì)感興趣的疾病通路中的新靶基因進(jìn)行驗(yàn)證可能催生新的治療策略。因此，能夠鑒定和驗(yàn)證miRNA/mRNA靶配對(duì)具有極其重要的意義。盡管生物信息學(xué)方法和自由能分析并不完美，但可使作者能夠?qū)ν茰y(cè)的miRNA/mRNA靶配對(duì)進(jìn)行鑒定。一旦生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)成功，可以通過(guò)以下4條標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證miRNA/mRNA靶配對(duì)的真實(shí)性。（1）miRNA/mRNA靶相互作用得到驗(yàn)證。（2）miRNA/mRNA共表達(dá)。（3）給定miRNA對(duì)其蛋白表達(dá)有可預(yù)測(cè)的影響。即用此miRNA的類(lèi)似物可減少靶基因表達(dá)水平，而用此miRNA特異性抑制劑可增加靶基因的表達(dá)水平。（4）miRNA介導(dǎo)靶基因表達(dá)的調(diào)控導(dǎo)致相應(yīng)的生物學(xué)功能的改變。