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ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase是基因表達(dá)調(diào)控研究中，最為核心、最為關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
圖1 核心實(shí)驗(yàn)（ChIP、RIP、RNA pull-down）原理示意
1 ChIP實(shí)驗(yàn)
通過(guò)與染色質(zhì)片段共沉淀和PCR技術(shù)，在體內(nèi)檢測(cè)與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段。將處于適當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)期的活細(xì)胞用甲醛交聯(lián)后將細(xì)胞裂解, 染色體分離并打碎為一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特異性抗體免疫沉淀目標(biāo)蛋白與 DNA交聯(lián)的復(fù)合物, 對(duì)特定靶蛋白與DNA片段進(jìn)行富集。采用低pH值條件反交聯(lián), DNA與蛋白質(zhì)之間的 Schiff鍵水解, 釋放DNA片段。通過(guò)對(duì)目標(biāo)片段的純化與檢測(cè),獲得DNA與蛋白質(zhì)相互作用的序列信息。
圖2 ChIP實(shí)驗(yàn)流程
2 RIP實(shí)驗(yàn)
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析；即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái)，結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測(cè)序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
圖3 RIP實(shí)驗(yàn)流程
3 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)
使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。
圖4 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)流程
4 EMSA實(shí)驗(yàn)
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。
圖5 EMSA實(shí)驗(yàn)原理
5 Luciferase實(shí)驗(yàn)
熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱(chēng)，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來(lái)催化不同的發(fā)光反應(yīng)。
螢光生成反應(yīng)通常分為以下兩步：
螢光素+ ATP→ 螢光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+ PPi
螢光素化腺苷酸+ O2→ 氧螢光素+ AMP +光
熒光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，將不同類(lèi)型的細(xì)胞（骨髓干細(xì)胞、T細(xì)胞等）標(biāo)記上（即表達(dá)）熒光素酶，就可以用高敏感度的CCD相機(jī)進(jìn)行對(duì)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行活體觀察而不會(huì)傷害到動(dòng)物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光，而發(fā)出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測(cè)器或改進(jìn)后的光學(xué)顯微鏡探測(cè)到。這就使得對(duì)包括感染在內(nèi)的多種生命活動(dòng)進(jìn)程進(jìn)行觀察成為可能。
圖6 Luciferase研究增強(qiáng)子原理
圖7 Luciferase常用載體
圖8 Luciferase片段缺失分析實(shí)驗(yàn)流程
圖9 Luciferase定點(diǎn)突變分析實(shí)驗(yàn)流程
熒光素酶分析可應(yīng)用于啟動(dòng)子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、藥物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報(bào)告基因檢測(cè)、活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析、難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（包括干細(xì)胞和原代細(xì)胞）的研究、RNA剪接研究。
雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試，是結(jié)合螢火蟲(chóng)和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報(bào)告基因測(cè)試技術(shù)。在用螢火蟲(chóng)熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí)，通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來(lái)減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng),結(jié)合pRL載體系統(tǒng)，表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試，快速、靈敏、簡(jiǎn)便。其應(yīng)用廣泛，可同時(shí)分析多個(gè)調(diào)控元件、同時(shí)分析多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、單次篩選一個(gè)以上的靶點(diǎn)（包括脫靶效應(yīng)、分析兩個(gè)或多個(gè)通路之間的相互作用）。