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在基因表達調(diào)控的研究中有各式各樣的方法，但究竟哪些方法應(yīng)用到哪些方向中呢？廣州賽誠生物科技有限公司根據(jù)過往經(jīng)驗，結(jié)合當今核心常用技術(shù)，做了以下總結(jié)。
1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控——蛋白調(diào)控DNA的研究方法
1.1 啟動子：基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。
1.1.1 轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測TSS
①預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點和啟動子區(qū)域
②預(yù)測CpG島
（2）5’-RAce初步確定TSS的大概位置
（3）引物延伸、核酸酶保護或S1作圖精確定位TSS
1.1.2 啟動子區(qū)域（順式作用元件）的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測啟動子區(qū)域
（2）克隆5’-flanking sequence，并連接到報告基因載體中
（3）缺失、突變
（4）熒光素酶活性分析
（5）確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(啟動子區(qū)域)
1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子（反式作用元件）結(jié)合位點的確定
（1）生物信息學(xué)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點
（2）實驗證實轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點：EMSA，ChIP，DNase I足跡分析
1.1.4 反式作用元件和順式作用元件相互作用對基因轉(zhuǎn)錄的影響
（1）定點突變：熒光素酶活性分析
（2）過表達轉(zhuǎn)錄因子：測定目的基因的表達
（3）干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達：測定目的基因的表達
（4）轉(zhuǎn)基因動物
1.2 增強子：基因組中能增強鄰近基因啟動轉(zhuǎn)錄的序列
（1）瞬時轉(zhuǎn)染——Luciferase熒光素酶法
（2）DNAase I hypersensitivity
（3）DNAase I footprinting/mutation analysis
（4）轉(zhuǎn)基因動物
2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控——蛋白調(diào)控RNA的研究方法
（1）RIP，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法
（2）RNA-Protein Pull-Down技術(shù)
其中，ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase、生物信息學(xué)等為其中的核心技術(shù)，也是未來的主要研究方法趨勢。接下來，廣州賽誠生物科技有限公司針對這些核心技術(shù)作進一步介紹。
1 免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation analysis，ChIP）
圖1 ChIP原理示意
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation ,簡稱ChIP) 是一種在體內(nèi)研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的發(fā)明最早可以追溯到20世紀60年代,早期曾多用于研究核小體上的DNA和組蛋白的相互作用以及組蛋白的修飾。近年來,此技術(shù)經(jīng)過不斷的發(fā)展和完善,特別是與DNA 芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合,可用于高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶點和研究反式作用因子在整個基因組上的分布情況。該技術(shù)在國外已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,但在國內(nèi)還鮮有報道,特別是在使用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶點方面,尚屬空白。
簡而言之,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA 片段才能夠被沉淀下來，后解除偶聯(lián)、純化目的片段并檢測等步驟來獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
ChIP能捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)水平上的基因表達調(diào)控的瞬時事件，如實、完整地反映DNA與蛋白質(zhì)的動態(tài)結(jié)合舊，但該方法尚存些不足，如：難以同時得到多個因子對同一序列結(jié)合的信息，或目標蛋白不是直接地與染色質(zhì)結(jié)合等。研究者不斷地發(fā)展和完善此技術(shù)，建立了廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選的CHIP—chip(芯片)方法。該技術(shù)能夠快速在目標基因組的染色體中確定特異DNA結(jié)合蛋白的準確結(jié)合位點， ChIP芯片也可以在一個基因組的任何感興趣的區(qū)域內(nèi)尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變。 ChIP-Chip被應(yīng)用于：
（1）在基因組范圍內(nèi)確定基因轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點和其他DNA結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合體的DNA結(jié)合位點。
（2）染色體活性狀態(tài)的定量分析。
（3）組蛋白修飾的功能研究。通過用酰基化或甲基化的組蛋白的特異抗體和沒有進行修飾的組蛋白的特異抗體，可以確定與組蛋白修飾有關(guān)的結(jié)合模式的變化。
（4）聚合酶活性的定量分析。
（5）精煉生物信息方法，用功能數(shù)據(jù)來確定啟動子的位置。
2 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法（RNA-Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）
圖2 RIP原理示意
RNA是一種不穩(wěn)定的生物大分子, 絕大多數(shù)的 RNA都需要與特定的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA/蛋白復(fù)合物才能穩(wěn)定存在于細胞中; 不僅如此, RNA 與 RNA 結(jié)合蛋白之間的動態(tài)關(guān)聯(lián)貫穿和伴隨了 RNA 的轉(zhuǎn)錄合成、加工和修飾、胞內(nèi)運輸和定位、功能發(fā)揮及降解的整個生命循環(huán)。鑒于此, 利用 RNA 結(jié)合蛋白分離或發(fā)現(xiàn)鑒定功能性 RNA 分子是 RNA研究領(lǐng)域中一個不可或缺的研究方法。
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。
簡單地說, 就是利用 RNA結(jié)合蛋白的抗體免疫沉淀 RNA/蛋白復(fù)合物, 再從沉淀的 RNA/蛋白復(fù)合物中分離得到特定 RNA結(jié)合蛋白的 RNA; 分離得到的 RNA可以通過末端標記和變性膠電泳對 RNA 分子的大小進行鑒定, 也可以利用高通量 RNA 測序方法對 RNA 序列進行分析。
3 RNA-Protein Pull-Down技術(shù)
圖3 RNA pull-down原理示意
蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細胞發(fā)育調(diào)控等。了解它們之間相互作用的分子機制對理解這些生物學(xué)過程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性標記，或?qū)嶒灢襟E過多，不僅耗時費力，也增加了實驗結(jié)果的不穩(wěn)定。以末端標記的RNA作為誘餌，輕松富集蛋白質(zhì)-RNA的相互作用。
RNA-Protein Pull-Down技術(shù)基本原理：使用體外轉(zhuǎn)錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用?；?qū)?fù)合物洗脫后所得未知混合蛋白質(zhì)譜檢測。
4 電泳遷移率變動分析(electrophoresis mobility shift assay，EMSA )
圖4 EMSA原理示意
電流遷移率變動分析又稱凝膠阻滯實驗(electrophoresis mobility shift assay)．是一種簡單、快速和極為靈敏的體外檢測DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它可實現(xiàn)對目的蛋白的定性和定量分析，此外，也可以用于構(gòu)象變化的分析。
在EMSA實驗中，純化的DNA特異結(jié)合蛋白或細胞粗提液和經(jīng)標記的DNA或RNA探針一同溫育，在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離蛋白質(zhì)——DNA復(fù)合物和游離的探針。這是因為蛋白質(zhì)——DNA復(fù)合物的遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的大小、形狀、電荷和對稱狀態(tài)，它的遷移速度要比游離的DNA慢得多，從而在凝膠上形成滯后帶。我們根據(jù)所顯示滯后帶的有無和量的多少，來反映DNA結(jié)合蛋白與DNA探針的結(jié)合活性、 DNA結(jié)合蛋白的表達水平，并可以計算出兩者的結(jié)合常數(shù)或解離常數(shù)。
凝膠遷移實驗需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（ Tris-HCl或HEPES）、還原劑（ DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（ poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非離子去污劑。
EMSA結(jié)合反應(yīng)一般都要設(shè)置如下結(jié)合反應(yīng)： 1 ，陰性對照反應(yīng)（標記探針）； 2，常規(guī)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標記探針）； 3，探針冷競爭反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記探針）； 4，突變探針的冷競爭反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記突變探針）； 5， Super-shift反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體）。
傳統(tǒng)的EMSA分析通常采用放射性同位素(如32p 3H)標記的寡核苷酸探針，該方法雖靈敏性高、特異性強，但因同位素的半衰期短，且易于污染環(huán)境、危害身體等因素，在一般的實驗室無法進行，其應(yīng)用的廣泛性受到了極大的限制。目前，人們已采用了地高辛和生物素標記的寡核苷酸來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性同位素標記的寡核苷酸，并在EMSA試驗中獲得成功。同時基于EMSA的基礎(chǔ)上發(fā)展了超遷移率變動分析 (supershift assay)和毛細管凝膠阻滯電泳，前者特異性要比EMSA好，常用于鑒定其他方法篩選出來的結(jié)果；后者樣品用量少、分辨率高，可用于一些受限制比較大的DNA——蛋白質(zhì)互作分析，如胚胎發(fā)育的研究過程。
5 Luciferase實驗
圖5 Luciferase研究增強子原理示意
Luciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。
6 生物信息學(xué)方法及生物芯片技術(shù)
生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學(xué)。它包含著生物信息的獲取、處理、存儲、分配、分析和解釋的所有方面。具體地說，生物信息學(xué)是用數(shù)理和信息科學(xué)的觀點、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈現(xiàn)指數(shù)增長的生物學(xué)數(shù)據(jù)的一門學(xué)科。 Luscombe和Thornton利用氨基酸序列的保守性構(gòu)建計算機算法來預(yù)測蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合體中DNA 的結(jié)合位點。 Selvaraj等將蛋白質(zhì)/ 核酸復(fù)合體中原子電荷勢能作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，利用人工智能技術(shù)來預(yù)測蛋白質(zhì)對DNA的識別位點。 Ahmad等將蛋白質(zhì)的序列組成、可溶解性以及二級結(jié)構(gòu)等信息數(shù)據(jù)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法進行訓(xùn)練，構(gòu)建了在線蛋白質(zhì)/ 核酸結(jié)合預(yù)測技術(shù)，預(yù)測成功率達到了69%。此后Ahmad 和Sarai將此技術(shù)進一步加強，在訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時加入了蛋白質(zhì)進化關(guān)系的信息，使預(yù)測成功率提高了8.7%。目前建立在 蛋 白 質(zhì) / 核 酸 相 互 作 用 基 礎(chǔ) 上 的 較 重 要 的 數(shù) 據(jù) 庫 為 蛋 白 質(zhì) , 核酸識別數(shù)據(jù)庫，利用該數(shù)據(jù)庫能幫助研究者了解核酸被蛋白質(zhì)識別的機制。
7 DNase I 足跡法(DNase I footprinting)
圖6 DNase I 足跡分析
足跡試驗的方法較多，常用的有DNase I足跡試驗、硫酸二甲酯足跡試驗(dimethylsulfate， DMS),二者原理基本相同,DNase I足跡法于1978年引入科研領(lǐng)域，其原理與DNA的化學(xué)測序法相似，首先將待測雙鏈DNA片段中一條鏈的一端選擇性地進行標記，然后加入恰當濃度的DNaseI， 使在DNA鏈上形成缺口，經(jīng)過變性后電泳分離，放射自顯影，即形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA條帶。但當DNA片段與相應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后， DNA結(jié)合蛋白可保護相應(yīng)的DNA序列不受DNase I 的攻擊，因此在放射自顯影圖譜上， DNA梯度條帶在相應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷，從而形成一空白區(qū)域，恰似蛋白質(zhì)在DNA上留下的足跡，因而被形象地稱作足跡法。如果同時進行DNA化學(xué)測序，即可判斷出結(jié)合序列的精確順序，該技術(shù)至今仍然是最常用的方法，但是在實際應(yīng)用中，首先應(yīng)將序列特異蛋白進行一定程度的純化，如硫酸銨分步沉淀，離子交換層析，凝膠過濾層析等，否則很難得到滿意的結(jié)果。因此在該足跡法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了固相DNaseI足跡法，它具有如下優(yōu)點： (1)采用生物素進行末端標記，避免放射性同位素的摻人，減少危害； (2)省略了有機抽提、沉淀等蛋白純化步驟，操作簡便，效率高； (3)使用范圍廣，可適用于未經(jīng)純化的核蛋白粗提物內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白的研究。
常與EMSA法結(jié)合共同用于體外DNA——蛋白質(zhì)相互作用的鑒定，但二者的側(cè)重點不同． EMSA主要用于與特異性DNA結(jié)合的目標蛋白的檢測，而DNase I足跡法在此基礎(chǔ)上進一步證明了DNA元件和目標蛋白的特異結(jié)合，并能告知與該蛋白結(jié)合的相應(yīng)DNA元件序列。
8 5’RLM-RACE技術(shù)
圖7 5’RLM-RACE技術(shù)
該技術(shù)主要用于確定TSS的大概位置。
9 酵母單雜交技術(shù)(yeast one hybrid system)
該技術(shù)是由Li JJ和Herskowitz I從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展來的。體外分析DNA與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過對酵母細胞內(nèi)報告基因表達狀況的分析，來鑒別DNA結(jié)合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點進行分析。運用此技術(shù)，能篩選到與DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優(yōu)勢；而且，酵母屬真核細胞，通過酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細胞內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。
酵母單雜交系統(tǒng)已被用于克隆多種重要的DNA結(jié)合蛋白，該系統(tǒng)相對直接、快捷、靈敏，篩選到的蛋白是在體內(nèi)相對天然條件下有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況，且無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作。但因細胞技術(shù)的先天局限性和所用報告基因His3或 lacZ的自泄漏表達等缺陷。在實際操作中常出現(xiàn)漏檢和假陽性現(xiàn)象。
10 SELEX與核酸適體技術(shù)
用 于 DNA- 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 研 究 的 指 數(shù) 富 集 配 體 系 統(tǒng) 進 化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX)技術(shù)誕生于上世紀90年代初，目前已經(jīng)成為在數(shù)量眾多的靶分子中，高親和性和特異性地確定適配了的一種嶄新的方法。 SELEX的流程即是人上合成隨機寡核苷酸序列、適配子篩選、擴增、再循環(huán)的過程。在這一過程中，適配子修飾基團文庫的應(yīng)用，使得SELEX流程更加經(jīng)濟，快捷，高通量。
SELEX是一種新型的體外篩選技術(shù)，它以DNA與蛋白質(zhì)相互作用為基礎(chǔ)建立隨機寡核苷酸文庫，從中篩選到能與各種配體(靶蛋白)特異性結(jié)合的單鏈寡聚核苷酸片段，長度一般為20～40bp，該寡核苷酸片段就稱為核酸適體(aptamer)。
SELEX技術(shù)的基本原理：首先人工合成一個含有1013～1015個單鏈寡核苷酸序列的隨機文庫，序列長度往往在25～35之間。而單鏈的隨機寡核苷酸序列，尤其是RNA，容易形成可與蛋白質(zhì)、核酸等靶物質(zhì)特異性共價結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡(hairpin)、莖環(huán)(stem-loop))、 G-四聚體(G-tetramer)等等。在這一高親和力特異性結(jié)合的基礎(chǔ)之上，靶物質(zhì)如氨基酸、多肽、甚至金屬離子都可以同隨機文庫(池)相互作用，選擇性分離出適配子，然后通過PCR等建立在轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上的技術(shù)，生成次一級文庫，再與靶物質(zhì)結(jié)合，反復(fù)多次循環(huán)，即可獲得與靶物質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的適配于。
在這一過程中，隨機序列寡核苷酸文庫在一個給定溫度的選擇性緩沖液池中，可以同靶物質(zhì)親和作用的特異性序列非常少，只有通過物理分離技術(shù)加以純化。大分子如蛋白質(zhì)可以通過硝酸纖維膜過濾；小分子如核酸、多肽等，可以通過簡單的修飾，添加上可以與固相支持物產(chǎn)生親和作用的基團，經(jīng)簡單的沖洗即可以達到純化目的。高親和性適配子的富集效率，取決于多重循環(huán)中每一次循環(huán)的嚴緊性，經(jīng)過多次的選樣性分離擴增后，達到了飽和狀態(tài)，富集的文庫被克隆，相應(yīng)的序列信息也被獲得。
適配子純化循環(huán)的次數(shù)取決于每一次循環(huán)的嚴緊程度。一般而言，對于大多數(shù)靶物質(zhì)在8～1 5次循環(huán)中剛可得到親和富集， 2天內(nèi)可完成一次SELEX循環(huán)，包括克隆和測序。一個典型的SELEX過程可能持續(xù)2～3個月。一旦序列確定，適配子可由化學(xué)合成來生產(chǎn)，少量適配子的純化和分析不超過3天，可以產(chǎn)生足夠數(shù)量(幾個摩爾)的適配子用于后繼的開發(fā)和研究。最近SELEX過程實現(xiàn)了自動化，將人為因素的干擾減少到最低。在微型自動化分析儀上可同時執(zhí)行多個獨立的重復(fù)SELEX過程，使適配子的發(fā)現(xiàn)更加快捷、經(jīng)濟和高通量。
據(jù)此，其篩選過程可簡單歸納為： (1)體外合成含1013～1015個單鏈寡核苷酸序列的隨機文庫； (2)在適宜條件下，孵育單鏈寡核苷酸庫與靶蛋白形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物； (3)分離未與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸； (4)解離與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸，以此為模板進行PCR擴增，得到特異結(jié)合的寡核苷酸庫，再進行下輪的篩選過程； (5)通過反復(fù)篩選與擴增，得到親合力強于抗原抗體之間的高特異核酸適體。
核酸適體技術(shù)已成為適配體篩選的有效工具，其所結(jié)合的靶分子范圍非常廣泛，除蛋白質(zhì)之外，還可以是酶、核酸、細胞黏附分子、植物凝集素、病原菌、有機物甚至是金屬離子等，且篩選到的適配體能識別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)?；谶@些特性，核酸適體技術(shù)已在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物篩選、生物傳感器等領(lǐng)域應(yīng)用。但需注意的是， SEIZX技術(shù)是體外實驗，其篩選到的核酸適體所表現(xiàn)出的一些優(yōu)良性質(zhì)，在體內(nèi)實驗中可能會完全失效；核酸適體與靶分子的非特異性結(jié)合及適配體的同源性、親和力等的影響，造成了SELEX的前期篩選工作的復(fù)雜性。這也是SELEX技術(shù)亟待解決的兩個問題。如果完成適配體的各種有效修飾及安全的藥物評價模型的構(gòu)建， SELEX技術(shù)存在的問題也將逐步解決。
11 熒光技術(shù)
該技術(shù)已廣泛用于生物分子之間的相互作用研究。由于核酸及其鏈上的堿基的熒光產(chǎn)率很低，蛋白質(zhì)組成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然熒光，所以采用“內(nèi)源熒光”的分析方法受到了很大的限制。用于研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的熒光法，主要是將熒光物質(zhì)修飾到蛋白質(zhì)或核酸分子上構(gòu)成新型熒光標記物質(zhì)并結(jié)合相關(guān)儀器而改造成新型的檢測技術(shù)。它對待測物質(zhì)的濃度要求低，靈敏度高且部分熒光技術(shù)可實現(xiàn)對待測物質(zhì)的動態(tài)分析等，基于這些優(yōu)點，在短短的幾年內(nèi)得到了迅速發(fā)展。
激光誘導(dǎo)熒光(Laser Induced Fluorescence． LIF)技術(shù)是常用的熒光技術(shù)之一，其靈敏度非常高，濃度檢出可達到10。13mol／ L，對于某些熒光效率高的物質(zhì)甚至可達單分子探測水平，且檢測時間短、樣品需要量少、可在線檢測等優(yōu)點。目前， LIF常與毛細管電泳(capillary electrophoresis， CE)連用形成毛細管電泳聯(lián)合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)CE-LIF，該技術(shù)成為生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等高靈敏檢測領(lǐng)域的首選技術(shù)之一。
12 掃描探針顯微技術(shù)
掃描探針顯微鏡(Scanning probe microscope． SPM)是掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope， STM)、原子力顯微鏡(atomic force microscope， AFM)、掃描近場光學(xué)顯微鏡(scanning near-field optical microscope， SNOM)、彈道電子發(fā)射顯微鏡(ballistic electron emission microscope， BEEM)、掃描力顯微鏡(scanning force microscope， SFM)
等一系列儀器的總稱，是上世紀被國際科學(xué)界公認為80年代世界十大科技成就之一。它利用探針尖端與樣品分子間的相互作用對生物分子進行成像，并以原子或分子分辨率探測生理環(huán)境下的生物表面力，所以通過該技術(shù)可觀察單個原子層的局部表面結(jié)構(gòu)，得到直觀的表面三維圖像和相關(guān)的表面結(jié)構(gòu)的信息，亦可以在生理條件下連續(xù)觀察生物樣品，了解某些生命活動的動態(tài)過程。其中，原子力顯微鏡(AFM)在研究DNA-蛋白質(zhì)的相互作用方面有著較廣泛的應(yīng)用，它能對每一個DNA、蛋白分子以及DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體分別觀察并進行定性和定量分析，提供更多真實直觀的信息。
SPM作為一種嶄新的技術(shù)手段，在研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的領(lǐng)域起到越來越重要的作用，但尚存在一些不足，如SPM掃描速度過低，滿足不了細胞內(nèi)的分子反應(yīng)速度；體外實驗?zāi)芊裾鎸嵎磻?yīng)細胞內(nèi)的生化反應(yīng)過程，固定表面的存在對DNA-蛋白質(zhì)反應(yīng)會產(chǎn)生哪些影響等問題尚未清楚。
13 生物質(zhì)譜技術(shù)和表面等離子共振技術(shù)
生物質(zhì)譜技術(shù)采用先進的軟電離技術(shù)使過去主要用于小分子研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了重大變革，它主要包括電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry， ESI—MS)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption／ ionization mass spectrometry， MAIDI—MS)、快原子轟擊質(zhì)譜(fast atom bombardment mass spectrometry， FAB—MS)和同位素質(zhì)譜(istope mass spectrometry)等，這些技術(shù)準確度、靈敏度和自動化程度高，對于研究結(jié)合位點十分有效，已成功地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的分析。
表面等離子共振(surface plasma resonance， SPR)是近年來新技術(shù)研究的熱點之一，它利用入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面(比如玻璃表面的金或銀鍍層)時所引起金屬自由電子的共振而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱甚至完全消失的物理現(xiàn)象，來獲取生物反應(yīng)過程中樣品的折射率與共振角(即反射光完全消失時的入射光角度，又稱SPR角)的動態(tài)變化，進而得到生物分子之間相互作用的特異性信號。 SPR技術(shù)可以原位、實時和動態(tài)地反映蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、新藥分子-疾病靶蛋白等生物分子間的互作信息，是分子間互作研究的有力手段，已廣泛地用于研究生物分子間的識別和特異性作用。