廣州市天河區(qū)黃埔大道中124號(hào)2705室
電話：020-29031124
手機(jī)：18102256923
Email：servers@gzscbio.com
Fax：020-85625352
QQ：2913120624
熒光素酶報(bào)告基因檢測法是轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中十分重要的實(shí)驗(yàn)手段。但其結(jié)果往往存在一定的誤差。為解決這一問題，現(xiàn)普遍采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測法。在雙熒光素酶報(bào)告基因測試中，將螢火蟲熒光素酶作為實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因，海腎熒光素酶作為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因。實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因用于測試實(shí)驗(yàn)條件下基因的表達(dá)，而對(duì)照?qǐng)?bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，以使實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因測試的結(jié)果歸一化。作歸一化可消除實(shí)驗(yàn)過程中減弱實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的變化，如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及裂解的效率等。在研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動(dòng)子活性中，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。
1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
1.1 細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按70%的匯合度接種到96孔板。
1.2 轉(zhuǎn)染：16h后轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和RNA，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔
（1）配制DNA和轉(zhuǎn)染試劑: 96孔板轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時(shí)每孔比例為pLenti：Firefly：Renilla：轉(zhuǎn)染試劑=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL
（2）稀釋好DNA及轉(zhuǎn)染試劑，常溫孵育5min
（3）將稀釋好的DNA分別和轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min
（4）每孔棄去15μL培養(yǎng)基，將15μL DNA轉(zhuǎn)染混合液添加到每孔細(xì)胞樣品中
（5）轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基
2 雙報(bào)告基因檢測
（1）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48h后，棄去培養(yǎng)基，用100μL 1XPBS洗1遍
（2）傾斜96孔板，吸干剩余的PBS
（3）去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫
（4）每孔加50μL稀釋好的1X PLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解
（5）白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10μL，加入100μL預(yù)先混好的LAR II，2s后測數(shù)據(jù)
（6）每孔添加100μL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)
- 1 . miRNA的概述
- 2 . lncRNA的概述
- 3 . miRNA與lncRNA研究策略
- 4 . miRNA與lncRNA研究實(shí)驗(yàn)
- 4.1. RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）Model Figures
- 4.2. RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗(yàn)流程
- 4.3. RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實(shí)驗(yàn)常見問題
- 4.4. RNA pull - down Model Figures
- 4.5. RNA pull- down實(shí)驗(yàn)流程
- 4.6. RNA pull- down實(shí)驗(yàn)常見問題
- 4.7. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）Model Figures
- 4.8. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗(yàn)流程
- 4.9. 熒光素酶檢測技術(shù)（Luciferase）實(shí)驗(yàn)常見問題