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一. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、搖菌
1. 取JM109感受態(tài)細(xì)菌80μl，加入1.5mlEP管中，用10μl槍頭沾取質(zhì)粒加入上述EP管中，混勻。
2. 冰上靜置30min。
3. 42℃熱休克90-120s。
4. 迅速移至冰上靜置2min。
5. 在超凈臺(tái)內(nèi)，于上述EP管中加入50μl LB培養(yǎng)基（Amp－），37℃，160rpm搖床，增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm離心10min，棄大部分上清，將沉淀重懸，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均勻，37℃倒置培養(yǎng)（過(guò)夜12-15h）。
7. 將37℃培養(yǎng)（12-16h）平板取出，于無(wú)菌操作臺(tái)中挑取單克隆放入內(nèi)含5ml LB培養(yǎng)基（Amp+）的15ml離心管中，于37℃、250rpm搖床增菌過(guò)夜18H,看菌液是否渾濁。菌液渾濁后進(jìn)行質(zhì)粒中提。
二. 質(zhì)粒中提（TIANGEN，DP107-02）
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。
2. 取1.5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。
3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1使用移液器徹底細(xì)菌沉淀。
4. 向離心管中加入250μl溶液P2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。
5. 向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12,000rpm，離心10min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。
6. 將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中， 12,000rpm，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
7. 向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm離心，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。
8. 向吸附柱CP3中加入600μl去蛋白液PW，12,000rpm離心，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。重復(fù)一次。
9. 將吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm離心2min。
10. 將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，放冰盒，測(cè)濃度。
三. 質(zhì)粒線(xiàn)性化：
本實(shí)驗(yàn)使用的酶為Biolabs的重組酶KpnⅠ。
酶切后進(jìn)行跑膠。
四. 瓊脂糖凝膠電泳
1. 配膠。成分：瓊脂糖粉、TBE、ⅠH2O，少量EB。
2. TBE與H2O混合加入放好瓊脂糖粉的錐形瓶中，搖勻，放入微波爐加熱1-2min。
3. 滴加少量EB，于錐形瓶中搖勻。
4. 倒入膠板中，插入梳子，待瓊脂糖凝固。
5. 小心拔掉梳子，取10μl樣品加入1μl 的10×Loading Buffer緩緩加入點(diǎn)樣孔，并在最右邊的點(diǎn)樣孔加5μlDNA maker。
6. 接通電源。
7. 電泳完畢，關(guān)閉電源。從膠模中取出瓊脂糖凝膠，于紫外燈下切下目的條帶。
五. 膠回收（TIANGEN，DP214-02）
1.向吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2. 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱(chēng)取重量。
3. 向膠塊中加入等倍體積溶液PC，50℃水浴放置10min左右，其間不斷的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。
4. 將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CB2中12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。
5. 向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。
6. 重復(fù)操作步驟⑤。
7. 將吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。
8. 將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，收集DNA溶液。
六. 轉(zhuǎn)錄以及生物素標(biāo)記：
1.取無(wú)RNA酶管，按下表操作：
1μg線(xiàn)性化DNA | xμl |
Biotin RNA Labeling mix | 2μl |
10×Transcription buffer | 2μl |
RNA Polymerase | 2μl |
補(bǔ)足RNase-free水至18μl | |
2. 取出孵育好的EP管，加入2μl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去體系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管，加入2μl0.2M EDTA（pH=8.0）終止反應(yīng)。
4. 取1μg Biotin標(biāo)記的RNA，加入適量Structure Buffer,使得RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后將RNA 95℃加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min。
5. 磁珠準(zhǔn)備：使用RIP Wash Buffer 500μl沖洗磁珠3次。
6. 用50μl RIP Wash Buffer重懸磁珠，然后將其加入到生物素標(biāo)記并變性的RNA中，4℃過(guò)夜。
7. 過(guò)夜的混合物3000rpm離心1min，去上清。
8. RIP Wash Buffer沖洗3次，切記將液體沿壁加入或者滴加，上下緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入細(xì)胞裂解液，裂解液中加入適量RNase抑制劑，室溫放置1h。
10. 將孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速離心，上清回收，使用RIP Wash Buffer沖洗3次，1次1ml。
11. 于樣品中加5×SDS上樣緩沖液，95℃變性10min，跑SDS-PAGE凝膠。
12. 考染：取出SDS-PAGE凝膠于考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖床過(guò)夜。次日用考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色1~2h，中間更換幾次脫色液至條帶清晰，背景低為止。
13. 將目的條帶切下送測(cè)序 (質(zhì)譜檢測(cè))。
- 1 . miRNA的概述
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