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實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程
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實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題
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結(jié)果分析
對(duì)于一幅RNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure，應(yīng)包含位點(diǎn)作用示意圖、WB或質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)分析圖，并應(yīng)在Supplement中補(bǔ)充相關(guān)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)圖片，具體如下圖所示。
RNA 序列： G表示空間構(gòu)象的變化， AS表示互補(bǔ)鏈的的二級(jí)結(jié)構(gòu)， S表示正義鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
Figure A：
用不同的A、AS、G RNA序列去Pulling Down蛋白符合物，并用不同的KCL濃度梯度洗脫。蛋白抗體NCL hnRNP U hnRNP F RPL7 hnRNP K的單抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)A AS G特定區(qū)段的結(jié)合的蛋白復(fù)合物的組分。
Figure B：
RNA Pull down后的將蛋白復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白NCL的肽段。不同RNA構(gòu)象A、AS、G結(jié)合的肽段的不同。
Figure C：
通過(guò)重組NCL到GST上，通過(guò)GST Pull down 捕獲符合物，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)RNA片段AS、S、G和細(xì)胞組成型表達(dá)RNA（Unbound RNA GAPDH）。
Figure D：
RNA Pull down結(jié)果進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。上面四泳道分別為不同的RNA捕獲方式，UTP生物素化，無(wú)生物素化等。
Supplement：
A RNA motif（結(jié)構(gòu)域）注釋和motif生物素化結(jié)合鏈霉親和素。
B 在不同的處理?xiàng)l件下（ATP depletion）下進(jìn)行RNA pulling down后用 Cup和Smaug 蛋白單抗進(jìn)行WB檢測(cè)。
C RNA Pull down的RNA探針，在加上Cap帽子結(jié)構(gòu)和不加帽子的情況下捕獲的蛋白用elF4G翻譯延伸因子 CuP蛋白進(jìn)行WB。有帽子結(jié)構(gòu)的才能有翻譯效應(yīng)。
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