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RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)（RIP）實驗流程

一. 細胞裂解液獲取

A. 單層細胞或者貼壁細胞處理

1. 冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞兩次

2. 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來，收集至enpendoff管

3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞

4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后于冰上靜置5min

5. 每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃

B.  懸浮細胞處理：先收集細胞再計數(shù)，然后清洗裂解

C.  組織樣品處理

1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次

2. 加入冷PBS后，用勻漿器或其他細胞分離設(shè)備使組織分散為單個細胞，計數(shù)

3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞

4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后置于冰上靜置5min

5. 每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃

二.  磁珠的準備

A. 實驗前準備

1、enpendoff管

2、磁力架

3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上

4、抗體，置于冰上

5、渦旋震蕩器6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min，槍噴DEPC水

B. 磁珠準備過程

1. 重懸磁珠

2. 標記實驗所需的enpendoff管，樣品包括目的樣品，陰性對照與陽性對照

3. 吸取50ul 重懸后的磁珠懸液于每個enpendoff管

4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩

5. 將enpendoff管置于磁力架上，并左右轉(zhuǎn)動15°使磁珠吸附成一條直線，去上清，重復一次

6. 用100ul的RIP Wash Buffer重懸磁珠，加入約5ug相應抗體于每個樣品中

7. 室溫孵育30min

8. 將enpendoff管置于磁力架上，棄上清

9. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復一次

10. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于冰上

三.  RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀

A. 準備工作

1、冰盒

2、360°旋轉(zhuǎn)儀

3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實驗過程

1. 準備RIP Immunoprecipitation Buffer

2. 將前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解凍第一步制備的細胞裂解液，14,000rpm，4℃離心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中，使得總體積為1ml

4. 4℃孵育3h至過夜

5. 短暫離心，將enpendoff管放在磁力架上，棄上清

6. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將enpendoff管放在磁力架上，棄上清，重復清洗6次

四、RNA純化

A. 實驗前準備

1. 槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min，噴DEPC水以除RNA酶

2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、異戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 離心機預冷

6. 冰盒

B. RNA純化過程

1.準備Proteinase K Buffer。每個樣品需150ul

2.用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物

3. 55℃孵育30min

4. 孵育完之后，將enpendoff管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer

6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：異戊醇，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min

7. 小心的吸取350ul上層水相，吸入另一新的enpendoff管

8. 于每管加入400ul氯仿，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min

9. 小心的吸取300ul上層水相，吸入另一新的enpendoff管

10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 無水乙醇（無RNase），混合，-80℃保持1h至過夜

11. 14,000rpm，4℃離心30min，小心去上清

12. 用80%乙醇沖洗一次，14,000rpm，4℃離心15min，小心去上清，空氣中晾干.

13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送測序


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